一、肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注治疗晚期癌性胸腹水（论文文献综述）
陈永强[1]（2019）在《肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究》文中认为肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用促进肿瘤免疫逃逸或炎症反应。近年来我们课题组证实,在肿瘤微环境中存在一种新型的LC-3II阳性的细胞外囊泡（LC-3II+Extracellular Vesicles,LC-3II+EVs）,主要来源于肿瘤细胞释放的分泌型自噬小体,我们将其命名为肿瘤细胞释放自噬小体（tumor cell released autophagosome,TRAP）。后续研究发现TRAPs携带的损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以诱导B细胞、单核/巨噬细胞和中性粒细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10+Breg细胞、PD-L1highIL-10+M2型巨噬细胞和产生大量ROS的中性粒细胞。CD4+T细胞是机体重要的抗肿瘤免疫细胞之一,目前关于CD4+T细胞亚群在肿瘤微环境中的分化机制及其免疫调节功能尚不完全清楚。因此本论文主要探讨TRAPs是否参与CD4+T细胞的分化和免疫调节,值得深入研究。目的:探讨TRAPs诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究,旨在阐明肿瘤微环境中―TRAPs—CD4+T细胞—肿瘤免疫微环境‖之间的免疫调控网络,为后期肿瘤免疫治疗提供新的靶点或治疗思路。方法:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4+T细胞分化的研究分选出WT小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的TRAPs分别诱导培养24 h或72 h后,收获细胞和培养上清,采用qRT-PCR和流式细胞术检测CD4+T细胞各亚群标志分子表达变化;ELISA检测培养上清中细胞因子的变化。C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs或皮下注射B16F10细胞构建荷瘤小鼠,流式细胞术检测各组小鼠脾脏和淋巴结中IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞的比例变化。2.TRAPs诱导CD4+T细胞分化的分子机制研究分选WT小鼠脾细胞来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的CFSE标记的TRAPs共孵育24 h后,激光共聚焦荧光显微镜观察CFSE标记的TRAPs与PE标记的CD4+T细胞或PE标记的TLR2的相互作用;流式细胞术检测CFSE-TRAP+CD4+T细胞比例。分选出WT、TLR2-/-、TLR4-/-、MyD88-/-和IL-6-/-CD4+T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导培养72 h后,ELISA检测培养上清中IL-6、IL-10和IL-21的浓度;分选WT CD4+T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导不同的时间,或用信号分子抑制剂或IL-6中和抗体等预处理1 h,Western Blot检测MAPKs信号通路中（JNK、ERK和p38）、NF-κB通路中（IKKα/β、IκBα和p65）、Akt或STAT3及其磷酸化水平;qRT-PCR和ELISA法检测CD4+T细胞IL-6、IL-21和IL-10的表达变化。将WT和IL-6-/-小鼠分别尾静脉注射TRAPs,检测脾脏和淋巴结中IL-21+CD4+T细胞和IL-10+CD4+T细胞比例变化。分选小鼠脾细胞来源的或人PBMCs中来源的CD4+T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入小鼠或人肿瘤细胞来源的TRAPs或预处理的TRAPs（超声破碎、蛋白酶K消化、抗体封闭或CFSE染色）分别诱导相应的时间后,分别检测CD4+T细胞中信号分子活化情况、IL-6表达和分泌水平。3.TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)免疫调节功能的研究3.1 TTRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究分选WT小鼠脾细胞来源的T细胞,在αCD3/CD28培养条件下,分别加入30%体积的正常培养CD4+T细胞上清（SN/CD4+T）和TRAPs诱导的CD4+T细胞上清(SN/TTRAP)或用IL-6、IL-10和IL-21中和抗体预处理的SN/TTRAP,培养72 h后,FACS检测IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T细胞比例。皮下免疫DC/OVA疫苗建立OVA特异性T细胞应答的小鼠模型或在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移CD4+T或TRAP诱导的CD4+T细胞,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,测脾细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射正常培养的WT CD4+T细胞和TRAPs诱导的WT CD4+T细胞或IL-6-/-CD4+T细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.2 TTRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究WT C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs诱导的CD4+T细胞,流式细胞术检测脾细胞中IL-10+B细胞的比例和数量。分选脾细胞来源的B细胞,单独或联合加入TRAPs、CD4+T细胞、SN/CD4+T、SN/TTRAP或分别用αIL-6、αIL-10和αIL-21预处理的SN/TTRAP培养72h后,检测各组IL-10+B细胞比例和IL-10的浓度。皮下免疫DC/OVA疫苗,建立OVA特异性T细胞应答小鼠模型或者在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移不同条件诱导的B细胞3次,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,采用流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,流式细胞术检测脾细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射不同条件诱导的B细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4+T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究利用慢病毒敲低自噬相关基因Becn1,构建自噬缺陷B16F10小鼠黑色素瘤细胞株,收集相同Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞数量来源的培养上清,采用Western blot检测上清中TRAPs的含量;ELISA检测两组上清体外诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的量。Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞皮下构建荷瘤小鼠,观察两组细胞体内生长速度差异;流式细胞术检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织和淋巴结中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞和IL-10+B比例变化;ELISA检测外周血中IL-6含量。将WT和IL-6-/-小鼠皮下接种B16F10细胞生长至第21 d后,测量肿瘤体积大小;流式细胞术检测各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B比例变化。结果:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4+T细胞分化的研究体外检测结果显示,TRAPs可以显着诱导CD4+T细胞高表达Il6和Il21,同时Il10和Il17的表达也有一定比例的升高,其它基因Il1b、Il2、Il4、Il8、Il9、Il22.、Ifng、Tnf、Tgfb1和Foxp3 mRNA表达变化不明显;与mRNA表达水平一致,TRAPs处理组IL-6、IL-10和IL-21的分泌量及IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞比例显着高于对照组,同时IL-21+CD4+T细胞表达Tfh细胞表型CXCR5和特异性转录因子Bcl6。与之相反,TRAPs处理组中IFN-γ+CD4+T细胞的比例显着降低,另外还发现TRAPs体外可以抑制IL-12诱导的CD4+T细胞向Th1细胞方向极化。体内检测结果显示,与荷瘤小鼠体内结果一致,TRAPs体内也可以诱导小鼠脾脏和淋巴结中IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T和IL-21+CD4+T细胞的比例的增高。以上结果证实TRAPs在体内外可以诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。2.TRAPs诱导CD4+T细胞分化的分子机制研究首先,TRAPs不能被CD4+T细胞所摄取而是结合于细胞表面发挥功能;TRAPs诱导WT和TLR4–/–CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的水平显着增加,而在TLR2–/–和MyD88–/–CD4+T细胞中IL-6、IL-10和IL-21的分泌量变化不明显;激光共聚焦显微镜检测结果显示TRAPs与CD4+T细胞表面的TLR2受体共定位,提示TRAPs通过TLR2-MyD88信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。随后,Western blot检测结果显示,TRAPs处理30-120min范围内CD4+T细胞中IKKα/β、I-kBα、p65、Akt、p38和STAT3的磷酸化水平显着增加,而ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平变化不明显,提示TRAPs可以活化CD4+T细胞中NF-κB、PI3K/Akt、p38和STAT3信号通路。当用相关抑制剂预处理后,NF-κB抑制剂Bay11-7082、PI3K抑制剂LY294002和p38抑制剂SB203580可以显着抑制IL-6,IL-10和IL-21的分泌,特别是Bay11-7082;而ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125对IL-6,IL-10和IL-21分泌均没有影响;STAT3抑制剂static可以显着抑制TRAPs诱导CD4+T细胞中STAT3的磷酸化水平及其IL-10和IL-21的分泌,而IL-6的分泌不受影响,说明TRAPs通过NF-κB、PI3K/Akt和p38信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,IL-10和IL-21,而IL-10和IL-21的分泌又受到STAT3进一步调控。最后体外检测发现,IL-6中和抗体可以显着抑制TRAPs诱导CD4+T细胞STAT3的磷酸化和IL-10和IL-21的分泌;同时,STAT3磷酸化、IL-10和IL-21表达和分泌在TRAPs诱导IL-6–/–CD4+T细胞中不发生明显变化;与体外结果一致,TRAPs体内诱导IL-6–/–C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏细胞中IL-21+CD4+T细胞和IL-10+CD4+T细胞的比例显着低于WT C57BL/6小鼠组。以上结果说明,TRAPs体内外通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,然后自分泌的IL-6再通过IL-6/STAT3通路进一步诱导IL-10和IL-21的分泌。B16F10、EL4、Hepa1-6和LLC细胞来源的TRAPs体外均可以诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6。用超声破碎或蛋白酶K消化后的TRAPs诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6的量显着降低,提示TRAPs主要是通过膜表面蛋白而非内容物发挥功能。当TRAPs分别用HSP60、HSP70、HSP90α和HMGB1封闭抗体封闭后,仅有HSP90α封闭抗体可以显着抑制TRAPs与CD4+T细胞的结合、胞内信号通路的活化以及IL-6的表达和分泌,提示TRAPs膜表面上HSP90α是诱导CD4+T细胞表达和分泌IL-6的功能分子。与小鼠肿瘤细胞来源的TRAPs结果相一致,临床肿瘤患者癌性胸/腹水或人肿瘤细胞（A375、MDA-MB-231和HepG2）来源的hTRAPs也可以显着诱导人外周血来源CD4+T细胞表达和分泌IL-6,当hTRAPs经HSP90α封闭抗体预处理后,CD4+T细胞表达和分泌IL-6的量也显着降低。以上结果说明,HSP90α是小鼠和人肿瘤细胞来源TRAPs诱导CD4+T细胞分泌IL-6的关键膜分子。3.TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)免疫调节功能的研究3.1 TTRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究T细胞功能实验结果显示:与对照组和正常培养的CD4+T细胞培养上清（SN/CD4+T）组相比,TRAPs诱导的CD4+T细胞培养上清(SN/TTRAP)可显着抑制体外αCD3/αCD28单抗刺激的CD4+T和CD8+T细胞IFN-γ的分泌;同时,TRAPs诱导的CD4+T细胞(TTRAP)体内也可以显着抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖以及IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例,提示我们CD4+T细胞经TRAPs诱导后可以抑制αCD3/αCD28非特异性和DC/OVA特异性诱导T细胞的免疫应答。另外,皮下瘤和肺转移瘤模型检测结果显示,TRAPs诱导的CD4+T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。抗体中和实验显示:与SN/TTRAP组相比,αIL-6预处理的SN/TTRAP组IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例显着提高,而αIL-10与处理组仅可以略微升高IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例,当αIL-6和αIL-10两种抗体联合预处理后,IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例可以完全恢复,说明TRAPs诱导的CD4+T细胞主要依赖分泌IL-6发挥T细胞功能抑制作用。与上述结果一致,TRAPs诱导的WT CD4+T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目的增加,而TRAPs诱导的Il6-/-CD4+T细胞体内对小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目不但没有促进作用,相反还具有一定的抑制肿瘤生长和肺肿瘤结节数。以上结果提示我们TRAPs诱导CD4+T细胞体内主要通过分泌IL-6发挥抑制T细胞功能作用,进而促进肿瘤的生长与肺转移。3.2 TTRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究TTRAP细胞体内可以显着诱导小鼠脾脏细胞中IL-10+B细胞的比例和数量的增加。体外结果显示SN/TTRAP也可以诱导IL-10+B细胞比例和IL-10分泌的显着增加;同时还发现,在体外CD4+T细胞可以显着的提高TRAPs诱导IL-10+B细胞的比例,提示TTRAP细胞和SN/TTRAP可以促进IL-10+B细胞的分化,同时TRAPs和CD4+T细胞在诱导B细胞分化成为IL-10+B细胞过程中具有一定的协同作用。抗体中和实验结果显示,当SN/TTRAP分别用αIL-6、αIL-10或αIL-21预处理后,IL-10+B细胞的比例均显着下降,说明SN/TTRAP中IL-6、IL-10和IL-21是协同增强TRAPs诱导IL-10+B细胞分化的关键细胞因子。OVA特异性T细胞应答小鼠模型中结果显示,SN/TTRAP联合TRAPs诱导的高比例的IL-10+B细胞(BTRAP+SN/TTRAP)体内抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖和OVA特异性的T细胞的能力显着高于TRAPs单独诱导的IL-10+B细胞(BTRAP)。皮下瘤和肺转移瘤模型也显示,与BTRAP细胞组相比,BTRAP+SN/TTRAP细胞体内可以更显着的促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。以上结果进一步证实:TRAPs诱导的CD4+T细胞可以进一步增强TRAPs诱导Breg细胞的生成及其免疫抑制功能。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4+T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究敲低自噬相关基因Becn1后,Becn1 KD B16F10细胞在饥饿条件下不仅细胞内的自噬水平低于Becn1 NC B16F10细胞,而且细胞外分泌型自噬小体TRAPs的分泌量也显着降低,同时Becn1 KD B16F10细胞体内的生长速度也显着低于Becn1 NC B16F10细胞。另外,Becn1 KD B16F10细胞荷瘤小鼠外周血中的IL-6浓度、淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞的比例显着低于Becn1 NC B16F10组,相反IFN-γ+CD4+T细胞的比例又显着高于Becn1 NC组。提示,靶向B16F10肿瘤细胞的自噬相关基因Becn1可以抑制体内肿瘤的生长,也可以逆转肿瘤微环境中CD4+T细胞和B细胞的分化。在WT和IL-6缺陷的C57BL/6小鼠构建B16F10黑色素瘤模型中,IL-6缺陷小鼠组中的肿瘤大小显着小于WT组,且IL-6缺陷小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10+CD4+T细胞、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞比例显着降低。推测荷瘤小鼠体内IL-6通过诱导IL-10+CD4+T细胞和IL-21+CD4+T细胞和IL-10+B细胞的分化发挥免疫抑制作用,进而发挥促进肿瘤生长的作用。提示,靶向肿瘤微环境中的IL-6可以逆转CD4+T细胞和B细胞的分化,进而机体的抗肿瘤免疫反应。结论:1.TRAPs体外可以诱导CD4+T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21,抑制CD4+T细胞向Th1细胞亚群分化,且TRAPs诱导获得的IL-21+CD4+T细胞表达Tfh细胞特异性转录因子Bcl-6和膜分子CXCR5。2.TRAPs膜结合型Hsp90α通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4+T细胞分泌IL-6,另外,p38和PI3K/Akt信号通路也参与了其中的调控。3.TRAPs诱导CD4+T细胞自分泌或旁分泌的IL-6又通过IL-6/STAT3通路诱导CD4+T细胞分泌IL-10和IL-21。4.TRAPs诱导的CD4+T细胞通过直接分泌IL-6和IL-10或间接诱导IL-10+Breg细胞发挥抑制T细胞免疫应答,最终促进肿瘤的生长与转移。5.敲低肿瘤细胞自噬相关基因Becn1或敲除小鼠体内Il6基因可以抑制肿瘤生长,也可以抑制IL-10+、IL-21+CD4+T细胞和IL-10+Breg细胞的分化。
代成成[2]（2017）在《DC-CIK联合化疗治疗晚期胃癌患者临床疗效及免疫状态的研究》文中研究表明消化道肿瘤常见的恶性肿瘤之一是胃癌,以手术治疗为主并结合传统放射治疗、化学治疗疗的综合治疗是当前治疗胃恶性肿瘤的主要方式。近些年来,研究表明,树突状细胞（dendritic cells,DCs）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells,CIK）共培养后得到的DC-CIK细胞,不仅增殖能力得到很好的加强同时对肿瘤的杀伤作用也得到大大提升。已经在血液系统肿瘤及一些实体瘤的治疗中进行了相关临床研究。目的:分析树突状细胞（Dendritic cells,DCs）及细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer,CIK）联合化疗在免疫状态变化、近期临床疗效等方面对晚期胃癌患者的影响。同时记录不良反应。探索其成为临床治疗手段的可能性及安全性。方法:选取集青岛大学第二临床医学医学院（青岛市中心医院）的肿瘤数据库里的2011年2月-2015年11月符合入组条件的50例晚期胃恶性肿瘤患者。其中将行DC-CIK细胞免疫治疗联合化学治疗的25例晚期胃癌患者设为观察组,并选择同期临床资料相近的仅行化学治疗的25例晚期胃癌患者设为对照组。对照组25例,接受的治疗方式仅为单纯化疗;观察组25例,接受的治疗方式为DC-CIK细胞免疫治疗联合化疗治疗。采用流式细胞术的方法分别对两组患者治疗前后T细胞亚群（CD3+、CD4+及CD8+）的比例进行检测,采用ELISA法分别对两组治疗前后细胞因子IFN-γ、IL-12及IL-2的分泌水平进行检测。统一根据RECIST标准对两组患者进行临床疗效评价。所有数据采用SPSS17.0统计软件录入数据进行分析,计量资料以“（?）±s”表示,采用t检验进行两两分析,认为P<0.05为差异有统计学意义。注意观察两组的不良反应。结果:观察组治疗后外周血中T细胞亚群CD4+、CD3+T细胞比值、细胞因子IFN-γ、IL-12较治疗前显着升高（P<0.05）,差异有统计学意义。对照组治疗后外周血中T细胞亚群CD8+T细胞比例较治疗前升高（P<0.05）,差异有统计学意义。而细胞因子IFN-γ较治疗前下降（P<0.05）,差异具有统计学意义。治疗后观察组和对照组的IL-2较治疗前比较均无显着性差异。观察组近期临床疗效较对照组有一定的改善,但无显着性差异（P>0.05）。在行DC-CIK细胞回输的过程中及回输结束后未见明显不良反应。结论:DC-CIK细胞免疫治疗胃癌是有一定的近期临床疗效的,在改善患者的免疫功能方面具有一定的优势,且安全性较好。它有望成为晚期胃恶性肿瘤一种有效的过继免疫细胞治疗方法。
杨秋玉,陈俊辉[3]（2016）在《靶向T细胞肿瘤治疗临床进展》文中提出T淋巴细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。根据细胞表面CD分子的不同,T细胞可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞活化后的主要效应细胞为辅助性T细胞（help T lymphocyte,Th）,CD8+T细胞活化后的主要效应细胞为细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）。CTL对肿瘤细胞起直接杀伤作用,Th对CTL的免疫活性起调节和促进作用。
杨如琳[4]（2016）在《HER2/neu抗原肽、CpG ODN联合Rg1诱导特异性CTL对卵巢癌抑制作用及其机制的研究》文中指出实验背景:卵巢恶性肿瘤是妇科最常见的恶性肿瘤之一,由于其发病隐匿、缺少有效的早期筛查手段,大部分患者初诊时即为卵巢癌晚期,故其死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。手术治疗、术后以铂类、紫杉醇为基础的联合化疗是常规的一线治疗方案,然而,上述治疗后,患者的临床结局并不理想,5年复发率和总生存期并未得到明显改善,这与术后患者体内的残余病灶以及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性密切相关。随着多学科协同发展,肿瘤免疫治疗学逐渐成为临床医学的关注重点,其中,过继性细胞免疫治疗更被认为是卵巢癌晚期免疫力较低患者的一种理想免疫治疗方式。它能够特异性地清除患者体内肿瘤微小残留病变,预防肿瘤复发、逆转肿瘤细胞化疗耐药,改善卵巢癌患者的临床结局。为探讨特异性CTL对卵巢癌杀伤作用及其机制,我团队在前期研究中,将含有Cp G基序的寡聚核苷酸序列（Cp G Oligodeoxynucleotide,Cp G ODN）和人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1,Rg1）联合作为免疫佐剂,与HER2/neu抗原肽结合建立特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）的体外大规模培养体系,并通过体外实验证实特异性CTL具有高度抗原特异性,在体外对卵巢癌细胞SKOV-3有显着的杀伤、抑制作用,能够破坏卵巢癌细胞SKOV-3正常的细胞周期,使之停滞在S期,同时亦可以调节多种凋亡基因,诱导卵巢癌细胞SKOV-3凋亡。并且,特异性CTL可以通过影响卵巢癌细胞SKOV-3PI3K/Akt通路相关蛋白的表达,抑制PI3K/Akt通路相关作用,从而发挥抗卵巢癌、逆转化疗耐药的作用。实验目的:研究特异性CTL对卵巢癌细胞SKOV-3的迁移和侵袭能力的影响,验证特异性CTL对荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞的杀伤、抑制作用及其对荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞凋亡、化疗耐药相关信号通路的影响。实验方法:第1部分:特异性CTL对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响。设立特异性CTL组（由健康志愿者外周血获得的PBMC经CpG ODN、人参皂苷Rg1、HER2/neu抗原肽刺激、诱导获得）、PBMC组（未刺激的健康志愿者外周血单个核淋巴细胞）、空白对照组,通过划痕实验,分别将特异性CTL、PBMC与贴壁卵巢癌细胞SKOV-3共培养,测定24h、48h划痕愈合程度来检测特异性CTL对SKOV-3细胞迁移能力的影响;通过Tranwell小室实验,检测特异性CTL、PBMC与SKOV-3细胞共培养24小时后SKOV-3细胞透过聚碳酸酯膜的数量,研究特异性CTL对SKOV-3细胞侵袭能力的影响。第2部分:特异性CTL对裸鼠体内卵巢癌抑制作用的研究。建立裸鼠皮下卵巢癌模型,将其随机分为三组（特异性CTL组、PBMC组、空白对照组）,并通过局部注射的方式给予相应治疗,连续7天治疗后,于第8天处死裸鼠,测量皮下瘤模型裸鼠皮下瘤的体积并称重,计算肿瘤抑制率,计算T/C值,检测治疗有效率。与此同时,建立裸鼠腹腔卵巢癌模型,并将其随机分为三组（特异性CTL组、PBMC组、空白对照组）,并通过腹腔注射的方式给予相应治疗,连续治疗7天后,于第8天处死裸鼠并进行剖检,收集腹腔种植瘤,称重,计算肿瘤抑制率。第3部分:特异性CTL逆转上皮性卵巢癌耐药相关机制的研究。收集上述各组皮下瘤及腹腔瘤,应用免疫组化染色方法对PI3K蛋白、Akt蛋白、Bcl-2蛋白、Caspase-3蛋白进行半定量检测,对荷瘤裸鼠体内特异性CTL对卵巢癌细胞对化疗耐药相关通路PI3K/Akt以及凋亡相关通路Bcl-2、Caspase-3的影响进行研究。实验结果:第1部分:1划痕实验结果显示,特异性CTL组SKOV-3细胞在24小时及48小时的迁移距离均明显小于PBMC组及空白对照组。2Transwell小室实验结果显示,特异性CTL组SKOV-3细胞在24小时时透过聚碳酸酯膜的数量明显小于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,组间差异有统计学意义。第2部分:1特异性CTL组皮下瘤体积明显小于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,组间差异有统计学意义。根据实验结果,T/C=29.80%,小于40%,治疗有效。2特异性CTL组皮下瘤重量明显小于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,与空白对照组对比,肿瘤抑制率IR=54.23%。3特异性CTL组腹腔瘤重量明显小于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,与空白对照组对比,肿瘤抑制率IR=70.61%。第3部分:1特异性CTL组免疫组织化学染色PI3K蛋白、Akt蛋白的表达均低于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,组间差异有统计学意义。2特异性CTL组、PBMC组、空白对照组免疫组织化学染色结果显示Bcl-2蛋白的表达均呈弱阳性,组间差异无统计学意义。3特异性CTL组卵巢癌细胞免疫组织化学染色Caspase-3蛋白表达高于PBMC组（p<0.05）及空白对照组（p<0.05）,组间差异有统计学意义。结论:由CpG ODN、人参皂苷Rg1、HER2/neu抗原肽刺激诱导获得的特异性CTL能够抑制体外卵巢癌细胞的迁移和侵袭,对荷瘤裸鼠体内的卵巢癌细胞亦具有一定的抑制作用,且其可能通过影响荷瘤裸鼠体内卵巢癌细胞PI3K/Akt通路、Caspase-3蛋白相关通路的作用而促进肿瘤凋亡、逆转化疗耐药,对Bcl-2相关凋亡蛋白影响不大。
周莉[5]（2016）在《人头颈部鳞癌ALDHhigh CSC DCs和细胞因子致敏T细胞、B细胞体外靶向ALDHhigh CSCs的研究》文中进行了进一步梳理目的:目前为止,很多种肿瘤预防疫苗的功能是用来预防病毒感染而不是预防肿瘤本身,但严格意义上讲,癌症疫苗是能够直接对癌症进行免疫治疗的。在前期研究中,我们使用ALDEFLUOR+/ALDHhigh作为肿瘤干细胞标志,诱导生成DC疫苗,该方法能够在小鼠体内产生明显的抗肿瘤反应。ALDEFLUOR+/ALDHhigh作为抗原来源较未分离的肿瘤细胞或者ALDEFLUOR-/ALDHlow肿瘤细胞更加能够诱导出抗肿瘤反应。本课题研究旨在明确头颈部鳞癌细胞ALDEFLUOR+/ALDHhigh细胞具有一定的抗原性,将此标志阳性的肿瘤干细胞作为抗原负载DC细胞后,能够诱导本身T细胞及B细胞较其他组别产生更强的抗肿瘤干细胞细胞免疫和体液免疫。方法:1.获取患者外周血单个核细胞,利用免疫磁珠分选技术分离T细胞、B细胞及CD3-/CD19-单个核细胞。刺激活化T细胞及B细胞,并将CD3-/CD19-单个核细胞培养成为DC细胞2.将患者肿瘤细胞传代,并将细胞进行ALDH染色。将细胞通过流式细胞仪,进行肿瘤细胞的ALDH表达情况的检测,分选得到ALDHhigh肿瘤干细胞,及同等比例的ALDHlow非肿瘤干细胞。将肿瘤细胞进行反复冻溶制成细胞裂解液,并同DC细胞共同培养,获得负载不同抗原成分的DC细胞。3.将负载不同抗原成分的DC细胞致敏T细胞及B细胞再次同ALDHhigh肿瘤干细胞/ALDHlow非肿瘤干细胞反应,检测T细胞的杀伤能力,使用ELISA方法检测细胞因子及抗体的生成情况,并检测抗体的特异性。结果:1.ELISA结果显示,致敏后的T细胞、B细胞再次针对ALDEFLUOR+/ALDHhigh反应时,负载ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞抗原的DC细胞致敏过的T细胞、B细胞能够产生更多的细胞因子IFN-γ、GM-CSF及细胞抗体Ig M、Ig G。2.杀伤实验结果证明,负载ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞抗原的DC细胞致敏过的T细胞能过杀伤最多的ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞。3.流式结果证明,负载ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞抗原的DC细胞致敏过的B细胞所产生的抗体Ig G,在Binding实验中显示出针对 ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞具有更强的结合力。HLA-ABC在ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞中的表达下降。结论1.自头颈部肿瘤患者外周血中提取的肿瘤干细胞能够用来生成DC细胞,并使用患者的肿瘤细胞培养成细胞系后,分选的ALDHhigh肿瘤干细胞和ALDHlow非肿瘤干细胞可以成为抗原成分,负载于DC细胞。HLA-ABC在ALDEFLUOR+/ALDHhigh肿瘤细胞中的表达下降,提示为肿瘤干细胞免疫逃逸机制相关。2.人头颈部鳞癌ALDHhighCSCs负载后的DC诱导T细胞产生特异性抗CSCs细胞反应。3.人头颈部鳞癌ALDHhigh CSCs负载后的DC诱导T细胞产生特异性抗CSCs细胞反应。Binding实验证明Ig G对肿瘤干细胞有更强的针对性,表明肿瘤干细胞具有一定的抗原特异性。
马克,杨继群,张洁,王洁,万焱,徐斌[6]（2016）在《医用三氧水灌注引流治疗恶性胸、腹腔积液各1例原始报告》文中研究说明恶性胸、腹腔积液在晚期恶性肿瘤患者的治疗多不理想,本科采用医用三氧水（臭氧水）灌注引流的方法对恶性胸、腹腔积液各1例做治疗,即使用100 ml浓度为18～20.4 μg/ml的医用三氧水灌注引流胸腹腔积液,每日1次,经过治疗,恶性胸、腹腔积液明显减少,其中1例无新生的胸腔积液出现,取得了良好效果。
尹志超[7]（2015）在《细胞免疫治疗联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床疗效分析》文中指出目的：探讨含有NK、CIK、γδT细胞的细胞免疫治疗联合化疗对复发性卵巢癌患者免疫功能、近期治疗效果、远期治疗效果、生活质量的影响及其安全性。方法：选取2009年9月至2014年8月于吉大一院就诊的初次复发的卵巢癌患者作为研究对象，根据是否接受细胞免疫治疗分为单纯化疗组和在化疗间歇期给予NK、CIK、γδT免疫细胞治疗的联合治疗组。比较两种治疗方法对患者免疫功能、有效率、疾病控制率、无进展生存期、总生存期、生活质量的影响，探讨联合治疗的安全性。结果：1．联合治疗组及单纯化疗组分别有33例和72例治疗规范、信息完整，纳入纳入研究。两组患者临床病理特征各项无统计学差异。中位随访时间16个月。本研究NK、γδT和CIK细胞在诱导前和诱导后的比例分别是10.13%（4.34-16.88%） vs92.32%（63.33-99.54%），4.93%（1.44-8.21%）vs37.25%（29.3125-58.18%），4.36%（2.61-11.29%） vs87.53%（62.34-97.98%）。2．多疗程（≥3）细胞免疫治疗后联合治疗组患者外周血CD3-CD56+、CD19+细胞水平明显高于单纯化疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。3.联合治疗组与单纯化疗组总有效率分别为33.3%和34.7%，疾病控制率分别为78.8%和73.6%，两组近期治疗效果差异无统计学意义（P＞0.05）。4.①联合治疗组患者中位PFS2为12.1个月（3.0～49.9个月），单纯化疗组患者中位PFS2为8.0个月（2.8～63.1个月），两组差异有统计学意义（P=0.044）；联合治疗组细胞免疫治疗疗程数≥3患者的PFS2长于单纯化疗组，差异有统计学意义（P=0.034）；②联合治疗组患者中位OS为18.2个月（3.2～63.9个月），单纯化疗组患者中位OS为13.5个月（3.1～63.1个月），两组患者总OS差异有统计学意义（P=0.046）；联合治疗组内细胞免疫治疗≥3疗程患者的OS长于单纯化疗组，差异有统计学意义（P=0.041）。5.治疗后联合治疗组疲倦症状较单纯化疗组改善明显，差异有统计学意义（P=0.04）。6.仅1人出现轻度细胞免疫治疗相关性发热，余不良反应两组差异无统计学差异（P＞0.05）。结论：细胞免疫治疗联合化疗治疗复发进展卵巢癌可改善患者免疫状态，延长生存期，提高生活质量，且是一种安全的治疗方法，其综合治疗效果优于单纯化疗。
徐梅[8]（2014）在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中进行了进一步梳理卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ14CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B17DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C12CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ14CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B17DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第1421天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第1421天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
王海龙[9]（2014）在《PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究》文中指出研究目的研究前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）在肺癌组织的肿瘤细胞和血管内皮细胞上的表达情况。分析PSMA在肺癌中表达情况与患者的年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、临床分期等因素的关系。构建AAV/PSMA质粒,制备AAV/PSMA病毒,用AAV/PSMA病毒转染树突状细胞,诱导生成细胞毒性T淋巴细胞。研究方法1.从天津医科大学附属肿瘤医院标本库选取非小细胞肺癌标本87例（包括鳞癌30例、腺癌29例、大细胞癌28例）,小细胞肺癌30例,正常肺组织标本33例。这些标本同时用PSMA抗体和CD31抗体进行了免疫组化。免疫组化的阳性对照选择前列腺癌组织,阴性对照选用PBS。2.复苏培养扩增高表达目的基因PSMA的LNcap细胞。用Trizol法从高表达目的基因的LNcap细胞中提取总RNA。用mRNA抽提试剂盒从总RNA中抽提mRNA。 RT-PCR方法将mRNA逆转录为cDNA并将逆转录的cDNA进行扩增。利用QIAGEN公司的凝胶抽提试剂盒抽提凝胶中的目的基因。用T4连接酶将目的基因与腺相关病毒载体进行连接。将连接产物与感受态细胞混合进行转化和涂菌。挑选生长良好的单克隆菌落用LB培养基进行扩增培养。单克隆菌落扩增之后进行质粒抽提。抽提的AAV/PSMA质粒分别用PCR和基因测序两种方法进行验证并与GenBank公开的PSMA序列对比吻合。无腺病毒参与的包装系统制备AAV/PSMA病毒。3. AAV/PSMA转染DC并诱导生成CTL取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞PBMC。取无菌10cm培养皿,按约8×107-12×107个细胞/皿,将PBMC加入培养皿中,补充AIM-V培养液。置二氧化碳培养箱培养,37℃,5%CO2,3小时。3小时后加入AAV/PSMA病毒,继续培养8小时。8小时后将悬浮的T淋巴细胞转移至T75或以上的细胞培养瓶中。根据悬浮细胞密度,决定需要培养液体积和细胞培养瓶的数量。培养瓶中加入细胞因子白介素-2,置二氧化碳培养箱中,37℃,5%CO2培养。培养皿底部贴壁细胞为树突状细胞。培养皿中加入AIM-V培养基、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4。第六天将DC和淋巴细胞混合培养（DC：淋巴细胞为1：20）。混合培养阶段应每天在倒置显微镜下观察细胞集落情况,若观察到细胞集落稍有松散,则可判定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）已经被激活,CTL细胞培养完成。流式细胞仪检测树突状细胞的表型CD83、CD80和CD86; CTL抗肿瘤杀伤活性的检测：用带荧光标记的CD4、CD8、CD25、CD69抗体标记CTL细胞,以流式细胞仪进行检测,得到所培养的CTL细胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表达情况；用FITC-anti-IFN-γ标记CTL,以流式细胞仪检测,得到CTL细胞中IFN-γ的表达情况。用不同MOI的病毒转染DC并用流式细胞仪进行检测,得至AAV/PSMA病毒转染DC的最佳MOI数值。研究结果1.在非小细胞肺癌中,PSMA在肿瘤细胞上的阳性表达率为54.02%,在肿瘤血管内皮细胞上的阳性表达率为85.06%；在小细胞肺癌中,肿瘤细胞上没有PSMA阳性表达,在肿瘤血管内皮细胞上PSMA阳性表达率为73.33%；在与肿瘤相邻的正常肺组织上没有发现PSMA表达。2.成功构建AAV/PSMA质粒并制备AAV/PSMA病毒；经PCR验证,构建的质粒中成功插入PSMA基因,长度为720bp；树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达比例分别为54%、83%和72%；CTL中CD8/CD4为1.12,CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表达分别为9.052%、42.76%和39%。研究结论PSMA特异性的表达于非小细胞肺癌的肿瘤细胞和血管内皮细胞；PSMA特异性表达于小细胞肺癌的肿瘤血管内皮细胞而不表达于肿瘤细胞；与肿瘤相邻的正常肺组织无PSMA表达；PSMA可能成为肺癌早期筛查的新标志物和治疗新靶点。以AAV为载体介导抗原基因PSMA转染DC可以成功诱导生成细胞毒性T淋巴细胞,PSMA作为肿瘤相关抗原在肺癌免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。
陈杰,罗晓玲,张力图[10]（2013）在《过继性免疫细胞治疗肾癌的临床研究进展》文中指出肾癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿外科常见的恶性肿瘤,其治疗手段以手术为主,晚期和转移性肾癌对化疗和放疗均不敏感。生物免疫治疗是肿瘤综合治疗的第四大模式,过继性免疫细胞治疗为目前生物免疫治疗中较为成熟和有效的方法,已在肾癌的临床治疗中取得较好疗效。近年有关过继性免疫细胞治疗肾癌的临床研究进展迅速,本文就此作一综述。
二、肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注治疗晚期癌性胸腹水（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注治疗晚期癌性胸腹水（论文提纲范文）
（1）肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述1 CD4~+T 细胞亚群分化机制及其在肿瘤中的研究进展 |
| 综述2 细胞外囊泡与肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)对CD4~+T细胞分化的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(一) |
| 第二章 TRAP诱导CD4~+T细胞分泌IL-6/IL-10/IL-21 的机制探讨 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(二) |
| 第三章 肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)诱导的CD4~+T细胞免疫调节功能及其抗肿瘤作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论(三) |
| 全文总结 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）DC-CIK联合化疗治疗晚期胃癌患者临床疗效及免疫状态的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 1.1 病例纳入和剔除标准 |
| 1.2 胃癌临床病例资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 DC细胞的制备 |
| 2.4 CIK细胞的制备 |
| 2.5 DC-CIK细胞联合制备 |
| 2.6 细胞质量控制 |
| 3 治疗方法 |
| 4 结果的检测 |
| 4.1 免疫治疗指标的检测 |
| 4.2 外周血细胞因子测定 |
| 5 近期疗效评价 |
| 6 不良反应的观察 |
| 7 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 两组外周血T细胞亚群的变化 |
| 2 两组外周血细胞因子变化 |
| 3 近期疗效 |
| 4 不良反应 |
| 讨论 |
| 不足及展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表（附录） |
| 致谢 |
（3）靶向T细胞肿瘤治疗临床进展（论文提纲范文）
| 1 肿瘤浸润淋巴细胞治疗 |
| 2 树突状细胞介导T细胞治疗 |
| 3 基因修饰T细胞治疗 |
| 3.1 TCR-T治疗 |
| 3.2 CAR-T治疗 |
| 4 小结 |
（4）HER2/neu抗原肽、CpG ODN联合Rg1诱导特异性CTL对卵巢癌抑制作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.3 研究思路及方法 |
| 第二章 特异性CTL对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 复苏培养后对数生长期的卵巢癌SKOV-3 细胞 |
| 2.2.2 经CpG ODN、人参皂苷Rg1、HER2/neu抗原肽刺激后获得的特异性CTL |
| 2.2.3 特异性CTL对卵巢癌SKOV-3 细胞迁移能力的作用 |
| 2.2.4 特异性CTL对卵巢癌SKOV-3 细胞的侵袭能力的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 特异性CTL对裸鼠体内卵巢癌抑制作用的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 裸鼠皮下卵巢癌模型的建立 |
| 3.2.2 裸鼠腹腔卵巢癌模型建立 |
| 3.2.3 裸鼠一般生长状况变化 |
| 3.2.4 裸鼠皮下卵巢癌模型皮下瘤体积及T/C值 |
| 3.2.5 裸鼠皮下卵巢癌模型皮下瘤重量及肿瘤抑制率 |
| 3.2.6 裸鼠腹腔卵巢癌模型腹围变化 |
| 3.2.7 裸鼠腹腔卵巢癌模型腹腔种植瘤重量及肿瘤抑制率 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 特异性CTL逆转上皮性卵巢癌耐药相关机制的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 统计学方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 免疫组化染色强度判定参照图 |
| 4.2.2 PI3K在卵巢癌组织中的表达 |
| 4.2.3 Akt在卵巢癌组织中的表达 |
| 4.2.4 Bcl-2 在卵巢癌组织中的表达 |
| 4.2.5 Caspase-3 在卵巢癌组织中的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及其在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）人头颈部鳞癌ALDHhigh CSC DCs和细胞因子致敏T细胞、B细胞体外靶向ALDHhigh CSCs的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、DC细胞培养及ALDH~(high) CSCs的分离 |
| 1.1 对象与方法 |
| 1.1.1 主要仪器及设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 病例来源 |
| 1.1.4 细胞系构建与培养 |
| 1.1.5 PBMCs磁珠分选 |
| 1.1.6 将CD3-CD19-外周单个核细胞培养成为树突状细胞 |
| 1.1.7 细胞表型分析 |
| 1.1.8 肿瘤细胞ALDH分选 |
| 1.1.9 肿瘤细胞裂解液的制备 |
| 1.1.10 肿瘤细胞裂解液冲击DC细胞制备DC疫苗 |
| 1.1.11 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HNSCC患者外周血中提取单个核细胞 |
| 1.2.2 头颈部鳞癌患者肿瘤细胞中ALDH~(high) 细胞的分析 |
| 1.2.3 HLA在ALDH~(high) 肿瘤干细胞和ALDH~(low)非肿瘤干细胞中的表达 |
| 1.2.4 外周血CD3-/CD19-单个核细胞上分子表面抗原的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 ALDH作为肿瘤干细胞的分选标记 |
| 1.3.2 HLA在ALDH表达 |
| 1.4 小结 |
| 二、人头颈部鳞癌ALDH~(high) 肿瘤干细胞负载后的DC能够诱导特异性T细胞抗肿瘤干细胞反应 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 主要仪器及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 体外激活及致敏T细胞 |
| 2.1.4 细胞杀伤能力实验 |
| 2.1.5 细胞因子检测 |
| 2.1.6 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ALDH~(high)-DC致敏后的T细胞对ALDH~(high) CSCs的杀伤能力增强 |
| 2.2.2 ALDH~(high)-DC致敏的T细胞针对ALDH~(high) CSCs分泌IFN-γ增多 |
| 2.2.3 ALDH~(high)-DC致敏的T细胞针对ALDH~(high) CSCs分泌GM-CSF增多 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、人头颈部鳞癌ALDH~(high) CSCs负载后的DC能够诱导B细胞产生特异性抗肿瘤干细胞体液 |
| 3.1 对象与方法 |
| 3.1.1 主要仪器及设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 体外激活致敏CD19+B细胞 |
| 3.1.4 抗体生成量检测 |
| 3.1.5 细胞抗体IgG检测 |
| 3.1.6 细胞抗体IgM检测 |
| 3.1.7 Bind实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 ALDH~(high)-DC致敏的B细胞针对ALDH~(high) CSCs分泌Ig M增多 |
| 3.2.2 ALDH~(high)-DC致敏的B细胞针对ALDH~(high) CSCs分泌Ig G增多 |
| 3.2.3 B细胞产生的Ig G具有一定得特异性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 CIK细胞及其在肿瘤治疗中的进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）细胞免疫治疗联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床疗效分析（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 肿瘤与机体免疫 |
| 1.2 细胞免疫治疗发展历程及现况 |
| 1.2.1 细胞免疫治疗发展历程 |
| 1.2.1.1 细胞免疫治疗体外研究历程 |
| 1.2.1.2 细胞免疫治疗体内研究历程 |
| 1.2.2 肿瘤细胞免疫治疗现况 |
| 1.3 化疗与细胞免疫治疗的相互作用 |
| 1.3.1 化疗增强肿瘤细胞免疫原性 |
| 1.3.2 化疗增强肿瘤细胞对免疫杀伤的敏感性 |
| 1.3.3 化疗解除免疫抑制 |
| 1.3.4 细胞免疫治疗缓解化疗的免疫损伤 |
| 1.3.5 细胞免疫治疗逆转化疗耐药 |
| 1.3.6 细胞免疫治疗降低治疗副作用 |
| 1.3.7 细胞免疫治疗治疗提高患者生活质量 |
| 1.4 卵巢癌与细胞免疫治疗 |
| 1.4.1 卵巢癌细胞免疫治疗的可行性 |
| 1.4.2 细胞免疫治疗用于卵巢癌治疗的现状 |
| 1.5 小结与展望 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 研究资料和方法 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 相关概念 |
| 3.3 治疗方案 |
| 3.4 治疗后评价 |
| 3.4.1 免疫功能评价 |
| 3.4.2 近期疗效评价 |
| 3.4.3 远期疗效评价 |
| 3.4.4 生活质量评价 |
| 3.4.5 安全性观察 |
| 3.5 统计学方法 |
| 第4章 研究结果 |
| 4.1 两组患者一般临床病理特征 |
| 4.2 回输免疫细胞质量评价 |
| 4.3 联合治疗前后患者的免疫情况 |
| 4.4 两组患者近期疗效评价 |
| 4.5 两组患者远期疗效评价 |
| 4.5.1 两组患者总体 PFS2、OS 情况比较 |
| 4.5.2 亚组分析患者的 PFS2、OS 情况比较 |
| 4.6 两组患者治疗前后生活质量比较 |
| 4.7 两组患者不良反应发生情况 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 一、EOC 的生物标志物 |
| 二、筛查策略 |
| 三、治疗 |
| 四、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
| 第一章 材料与方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
| 第一章 材料和方法 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
| 第一章 资料与方法 |
| 第二章 临床病例资料结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一：CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：miRNA 与卵巢癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 本研究所获的基金资助 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（9）PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PSMA在肺癌中表达情况的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AAV/PSMA转染DC诱导CTL |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述一 |
| 综述参考文献 |
| 综述二 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）过继性免疫细胞治疗肾癌的临床研究进展（论文提纲范文）
| 1 肾癌微环境对过继性免疫细胞的影响 |
| 2 过继性免疫细胞在肾癌生物治疗中的应用 |
| 2.1 树突状细胞(DC) |
| 2.1.1 肿瘤细胞裂解物抗原致敏DC |
| 2.1.2肿瘤抗原肽负载DC |
| 2.1.3 肾癌m RNA转染的DC |
| 2.1.4 肾癌细胞与DC融合疫苗 |
| 2.2 CIK细胞或DC-CIK细胞联合治疗 |
| 2.3 TIL细胞 |
| 2.4 γδT细胞 |
| 2.5 嵌合抗原受体修饰T细胞 |
| 3 问题与展望 |
四、肿瘤抗原致敏的树突状细胞联合IL-2活化的淋巴细胞胸腹腔输注治疗晚期癌性胸腹水（论文参考文献）
- [1]肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导CD4+T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究[D]. 陈永强. 东南大学, 2019(05)
- [2]DC-CIK联合化疗治疗晚期胃癌患者临床疗效及免疫状态的研究[D]. 代成成. 青岛大学, 2017(02)
- [3]靶向T细胞肿瘤治疗临床进展[J]. 杨秋玉,陈俊辉. 实用医学杂志, 2016(17)
- [4]HER2/neu抗原肽、CpG ODN联合Rg1诱导特异性CTL对卵巢癌抑制作用及其机制的研究[D]. 杨如琳. 吉林大学, 2016(08)
- [5]人头颈部鳞癌ALDHhigh CSC DCs和细胞因子致敏T细胞、B细胞体外靶向ALDHhigh CSCs的研究[D]. 周莉. 天津医科大学, 2016(06)
- [6]医用三氧水灌注引流治疗恶性胸、腹腔积液各1例原始报告[J]. 马克,杨继群,张洁,王洁,万焱,徐斌. 实用疼痛学杂志, 2016(01)
- [7]细胞免疫治疗联合化疗治疗复发性卵巢癌的临床疗效分析[D]. 尹志超. 吉林大学, 2015(09)
- [8]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
- [9]PSMA在肺癌表达及免疫治疗临床应用价值的初步研究[D]. 王海龙. 天津医科大学, 2014(01)
- [10]过继性免疫细胞治疗肾癌的临床研究进展[J]. 陈杰,罗晓玲,张力图. 中国癌症防治杂志, 2013(03)