野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性的影响

一、野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性影响（论文文献综述）

常顺^[1]（2018）在《Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究》文中研究表明目的:近年来研究发现支架蛋白Gab2（Gab2-associated binding protein 2）在多种恶性肿瘤中高表达,其表达增高与肿瘤的发生发展密切相关。同时有研究显示Gab2蛋白在胶质瘤组织中也存在高表达的趋势,但其转录水平和表达水平对胶质瘤发生发展的影响尚无定论。对胶质瘤组织中Gab2mRNA进行检测,定量分析Gab2转录水平,并将其与临床病理特征和胶质瘤影像学资料进行关联分析,将有利于进一步解释Gab2表达水平对胶质瘤发生发展的调控机制。所以本研究将对胶质瘤和瘤旁组织中的Gab2mRNA进行检测,并分析其与临床病理和影像学资料各因素间的关系;进一步建立科学、规范的Sprague-Dawley大鼠脑胶质瘤原位移植模型;通过敲减Gab2的表达,研究其对C6胶质瘤细胞在体外和SD-大鼠脑内增殖和凋亡的影响,及对细胞因子IL-6、TNF-a、VEGF和肿瘤相关因子 MMP-2、MMP-9,Bax、Bcl-2、p53、Cleaved-caspase-3 表达的影响;初步阐明Gab2表达水平与胶质瘤发生发展的关系,探讨Gab2的表达对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制,为寻求胶质瘤的有效治疗方法打下基础。方法:1.搜集临床胶质瘤患者样本40例,对其临床病理及影像学资料进行归纳总结,并应用qRT-PCR分别检测40例胶质瘤和瘤旁组织中Gab2mRNA的相对表达量,分析其表达差异,并研究其表达与临床病理特征及瘤周水肿的关系;2.利用胶质瘤细胞系C6研究Gab2对胶质瘤细胞的功能调控机制,将其分为对照组、空载体组及Gab2-siRNA组进行细胞Gab2-siRNA转染,以靶向沉默、敲减细胞中Gab2基因的表达,转染后48h用western-blot分别检测三组细胞Gab2蛋白的表达,验证转染效率,并于转染后72h用流式细胞仪检测三组细胞的凋亡情况;3.利用胶质瘤细胞系C6和SD-大鼠建立胶质瘤动物模型进一步研究Gab2对胶质瘤细胞体内增殖和凋亡的调控机制。将SD-大鼠分为三组:对照组、Gab2-siRNA组,每组47只,空白组5只;分别将数目相同的C6胶质瘤细胞和经Gab2-siRNA转染的C6胶质瘤细胞立体定向接种于对照组和Gab2-siRNA组SD-大鼠的右脑尾状核,构建动物模型,空白组5只则用等体积的生理盐水代替;在建模2周后,随机选取对照组和Gab2-siRNA组大鼠各15只行灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率;建模3周后,将对照组、Gab2-siRNA组大鼠各30只取眼眶血后和空白组大鼠5只灌注后处死,剖颅探查取瘤,检测肿瘤的瘤重和体积,计算成瘤率,与建模2周后的肿瘤瘤重、体积和成瘤率相比较;利用HE染色法明确肿瘤病理学特征,并采用GFAP染色法判断肿瘤来源,免疫组化染色检测肿瘤Bax、Bcl-2蛋白的表达水平;采用qRT-PCR和western-blot检测肿瘤MMP-2、MMP-9转录水平及蛋白表达水平;应用Western-blot检测肿瘤中Bax、Cleaved-caspase-3和p53蛋白的表达水平;采用ELISA检测经剖颅证实荷瘤成功的对照组及Gab2-siRNA组大鼠血清中细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达水平,并用电镜观察比较两组肿瘤细胞的超微结构。结果:1.Gab2在胶质瘤组织中的转录水平显着高于瘤旁组织（P<0.01）;且随着胶质瘤病理级别的升高及瘤周水肿的加重,Gab2-mRNA相对表达量的升高有显着统计学差异（P<0.01）,但其在不同性别和年龄间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞后,与对照组和空载体组相比,Gab2-siRNA组Gab2蛋白的表达显着降低（P<0.01）,对照组及空载体组中Gab2蛋白的表达则无明显差异（P>0.05）;且对照组细胞的凋亡率与空载体组相比无明显差异（P>0.05）,而Gab2-siRNA组细胞凋亡率与对照组和空载体组相比明显增高,具有显着性差异（P<0.01）。3.剖颅探查取瘤、检测肿瘤体积和重量和计算成瘤率结果示:建模3周后肿瘤的体积和瘤重显着高于2周后（P<0.01）;同期,Gab2-siRNA组的肿瘤体积和瘤重显着低于对照组（P<0.01）,成瘤率稍低于对照组,但无统计学差异（P>0.05）,空白组无肿瘤形成。4.HE染色示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞异型性较小,核浆比例下降,病理性核分裂象和新生血管较少。两组肿瘤GFAP染色都呈阳性,说明肿瘤来源于神经胶质细胞,而非其它性质肿瘤,可用作后续研究。5.两组肿瘤组织中均有Bax和Bcl-2蛋白的表达;与对照组相比,Gab2-siRNA组Bcl-2蛋白的表达强度减弱（P<0.05）,Bax蛋白的表达强度则明显升高（P<0.01）。6.与对照组相比,Gab2-siRNA组中MMP-2、MMP-9的mRNA的相对表达量和MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平显着低于对照组（P<0.01）。7.与对照组相比,Gab2-siRNA组p53、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白的表达水平明显升高（P<0.01）。8.与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞因子IL-6、TNF-α、VEGF的表达明显降低（P<0.05）。9.电镜检查示:与对照组相比,Gab2-siRNA组细胞凋亡征象明显多见。结论:1.Gab2基因在胶质瘤组织中的表达显着高于瘤旁组织（P<0.01）,且其表达明显受到胶质瘤的病理分级及瘤周水肿程度的影响;提示Gab2可能在肿瘤组织中特异性高表达,与胶质瘤的发生发展关系密切,有望成为一个新的分子靶点。2.Gab2-siRNA转染C6胶质瘤细胞效率较高,能显着降低Gab2蛋白的表达水平（P<0.01）,敲减Gab2能明显促进体外C6胶质瘤细胞的凋亡（P<0.01）;SD-大鼠脑尾状核C6胶质瘤模型成瘤周期较短,成瘤率高,模型稳定性好,是一种较为理想的胶质瘤动物模型。3.敲减Gab2能明显抑制C6胶质瘤细胞在SD-大鼠脑内的增殖和生长并促进其凋亡,减轻瘤重、缩小肿瘤体积。其机制可能与敲减Gab2下调了MMP-2、MMP-9和IL-6、TNF-α、VEGF的表达、升高Bax和下调Bcl-2的表达进而升高了Bax/Bcl-2的比值、活化了凋亡信号途径p53/Bax/Cleaved-caspase-3有关。

吉利^[2]（2009）在《健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞干预的机制研究》文中研究指明目的:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,发展速度快、恶性程度高、预后差、生存期短,严重威胁到人类的身心健康。随着现代医学治疗手段的发展,癌肿局部治疗方面的优势已非常突出,但在综合评估患者生存质量、生存期和远期疗效等方面仍然不尽人意。因此,着眼于整体以及整体病机对肿瘤形成和演变的影响,日益受到重视。越来越多的证据表明,中医药在改善肝癌患者的免疫状态、提高生存率方面有着独特的疗效。在中医药防治肝癌的临床实践中,应用与研究较多的为健脾理气法。健脾理气方药是我院临床多年来一直应用的一种有效的抗癌方剂,由人参、黄芪、云苓、白术、升麻、陈皮、柴胡、当归八味中药组成。从动物实验入手,探讨该方剂对肝癌细胞的干预机制可为中医药治疗肝癌提供可靠的科学依据。方法:建立小鼠脾虚肝郁的动物模型,再选用小鼠Hca-F腹水型肝癌细胞株,制作移植瘤动物模型。造模形成实体瘤后将小鼠随机分成荷瘤对照组、健脾理气方药组、环磷酰胺组和健脾理气方药+环磷酰胺组,各组分别以生理盐水、健脾理气方药、环磷酰胺、健脾理气方药+环磷酰胺灌胃。另设正常对照组,以生理盐水灌胃。停药后24小时取材。应用光镜技术观察健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞形态学的影响;应用流式细胞术检测健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+的影响:应用光镜-酶细胞化学染色法检测健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠外周血淋巴细胞Mg2+-ATP酶与G-6-P酶活性的影响;应用电镜技术与TUNEL法检测健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞凋亡的影响:应用原位杂交法检测健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞端粒酶活性的影响;应用免疫组化法检测健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞突变型p53、Bcl-2、C-myc基因蛋白表达的影响。结果:1.光镜下观察,各实验组与肿瘤对照组比较,癌细胞排列较规整,体积变小。病理性核分裂较少,染色质浓缩,密度增高。间质可见较多的淋巴细胞等炎性细胞浸润,毛细血管内肿瘤细胞少见。周围坏死灶面积增大。2.健脾理气方药组抑瘤率为26.8%,健脾理气方药+环磷酰胺组抑瘤率为38.8%。说明健脾理气方药可以抑制肿瘤生长,且与环磷酰胺合用后抑瘤效果明显增强。3.流式细胞术检测结果表明,各治疗组在用药后CD4+T细胞、CD4+/CD8+与荷瘤对照组相比均有明显升高,CD8+T细胞较用药前降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）,健脾理气方药组、健脾理气方药+环磷酰胺组与环磷酰胺组相比,其治疗效果均无显着性差异（P＞0.05）。4.光镜-酶细胞化学染色法结果表明,与荷瘤对照组比较,各治疗组外周血淋巴细胞内Mg2+-ATP酶、G-6-P酶活性明显增强,Mg2+-ATP酶、G-6-P酶阳性细胞率与荷瘤对照组比较差异显着（P＜0.01）,各治疗组之间上述两种指标无统计学差异（P＞0.05）。5.电镜下观察,可见细胞凋亡的特异性标志——凋亡小体形成。6.TUNEL法检测结果显示,各治疗组与荷瘤对照组相比凋亡细胞明显增多,凋亡指数增高,差异显着（P＜0.01）,尤以健脾理气方药+环磷酰胺组增多最为明显。环磷酰胺组与健脾理气方药组之间凋亡指数无明显差异（P＞0.05）,而健脾理气方药+环磷酰胺组与健脾理气方药组之间的凋亡指数具有统计学差异（P＜0.05）,说明健脾理气方药与环磷酰胺合用在促进肿瘤细胞凋亡方面具有协同作用。7.原位杂交法结果表明,与荷瘤对照组相比,各治疗组端粒酶活性降低,差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,各治疗组之间端粒酶活性无统计学差异（P＞0.05）。8.免疫组化法结果表明,各治疗组的突变型p53、Bcl-2和C-myc基因蛋白的阳性表达率均低于肿瘤对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,各治疗组之间上述三种基因蛋白的阳性表达率无统计学差异（P＞0.05）。结论:1.健脾理气方药具有抑制Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞增殖的作用,且与环磷酰胺合用后抑瘤效果明显增强。2.健脾理气方药具有增强Hca-F肝癌小鼠外周血淋巴细胞Mg2+-ATP酶以及G-6-P酶活性的作用,具有调节Hca-F肝癌小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+的作用,从而改善荷瘤小鼠的免疫状态。3.健脾理气方药具有降低Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞端粒酶活性的作用,从而促进肝癌细胞凋亡。健脾理气方药与环磷酰胺合用在促进肿瘤细胞凋亡方面具有协同作用。4.健脾理气方药具有降低Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞突变型p53、Bcl-2、C-myc基因蛋白的阳性表达率的作用。

李高鹏^[3]（2009）在《碘油羟基磷灰石纳米颗粒介导对肝癌靶向基因治疗的实验研究》文中指出第一部分羟基磷灰石纳米颗粒作为基因载体可行性的研究目的对羟基磷灰石纳米材料颗粒（nHAP颗粒）的物理属性进行检验看其是否可能作为基因载体。方法利用了Ca2+及左旋多聚赖氨酸（PLL）对其进行表面修饰；应用原子力学显微镜，透射电镜，Zeta电位分析仪分析羟基磷灰石纳米材料颗粒的颗粒大小，分布情况及颗粒表面的带电情况；应用琼脂糖凝胶电泳，兔血清消化法观察nHAP颗粒对质粒DNA的结合情况；利用了以上结果与目前基因转移到了最新理论要求比较，判断此材料是否可能作为基因转移载体并为基因转移提供科学依据。结果nHAP颗粒本身大小小于100nm，但由于颗粒表面本身带负电，不能包括有效地结合及保护DNA；经Ca2+修饰后，颗粒可带正电，可一定程度地结合和保护DNA，但聚合物本身的中性电与带负电的细胞膜结合，而且本身的颗粒则变地容易聚集而成为很大的颗粒，也不利于细胞的吞噬；经PLL修饰后，颗粒溶解性提高，直径变小，表面带正电，电泳结果显示PLL-nHAP颗粒可包括有效地结合和保护DNA免受兔血清的破坏，而且复合物表面的正电也包括有利于与细胞膜的结合与吞噬。无论哪种修饰方法，nHAP颗粒与DNA质量比必须达到了15才能完全结合和保护DNA。结论nHAP颗粒本身不可作为基因转移到了载体。经过PLL修饰后可作为基因转移载体，nHAP颗粒与DNA质量比必须达到了15才能完全结合和保护DNA。第二部分野生型P53，Rb抑癌基因真核细胞表达载体的构建目的：利用了分子生物学的基本原理构建野生型P53，Rb抑癌基因真核细胞表达载体。方法：（1）：Trizol法提取正常胎肝细胞L02 mRNA后，利用了RT-PCR克隆野生型P53基因的全长CDNA。利用了Xho和BamHⅠ分别酶切CDNA的两端后，与相同酶切的PEGFP-C2真核细胞表达载体连接后转化，提取重组质粒后进行酶切，PCR鉴定正确后，进行测序验证。（2）：Trizol法提取正常足月胎盘组织mRNA后，利用了巢式RT-PCR克隆野生型Rb基因的全长CDNA。利用了Xho和BamHⅠ分别酶切CDNA的两端后，与相同酶切的PBK-CMV真核细胞表达载体连接后转化，提取重组质粒后进行酶切，PCR鉴定正确后，进行测序验证。结果：（1）：成功克隆1.2kb野生型p53基因，并亚克隆到了4.7 kb真核细胞表达载体PEGFP-C2，p53基因与EGFP在一个阅读框内形成一个融合基因，其重组载体称为PEGFP-C2-p53。（2）：成功克隆2.9 kb野生型Rb基因，并亚克隆到了4.5kb真核细胞表达载体PBK-CMV内，其重组载体称为PBK-CMV-Rb。结论：成功构建人携带野生型P53，Rb基因真核表达质粒PEGFP-C2-P53，PBK-CMV-Rb。第三部分羟基磷灰石纳米在体外基因转染的研究目的研究新型非病毒载体羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）纳米颗粒在体外对肝细胞癌细胞基因治疗中的作用及机制。方法（1） MTT法评价各个浓度HAP纳米颗粒对肝细胞癌细胞HePG2及正常肝细胞L02生长的影响，从而选择合适的剂量使用范围用于后续实验。（2）应用氯化钙修饰HAP纳米颗粒，以增强型绿色荧光蛋白基因（PEGFP-N1）为报告基因，联合脂质体共同作为基因载体转染肝细胞癌细胞HePG2，荧光显微镜下观察转染成功后，流式细胞术测定转染效率和平均荧光值，并与传统脂质体方法进行比较。（3）应用PLL修饰HAP纳米颗粒，以增强型绿色荧光蛋白基因（PEGFP-N1）为报告基因，作为基因载体转染肝细胞癌细胞HePG2，荧光显微镜下观察转染成功后，流式细胞术测定转染效率和平均荧光值，并与传统脂质体方法进行比较。（4）应用PLL修饰HAP纳米颗粒，以p53基因（PEGFP-C2-p53）目的基因，作为基因载体转染肝细胞癌细胞HePG2，荧光显微镜下观察转染成功后，流式细胞术测定癌细胞的凋亡率和死亡率，并与传统脂质体方法进行比较。结果（1）体外应用nHAP颗粒不能超过终浓度20ug／ml，联合脂质体应用nHAP颗粒不能超过终浓度5ug／ml。由于第一部分研究结果提示nHAP颗粒与DNA质量比必须达到了15才能完全结合和保护DNA。故后续浓度选用nHAP颗粒与DNA各为15ug／ml及1ug／ml。（2）氯化钙修饰的HAP纳米颗粒单独应用无基因转移功能。联合HAP纳米颗粒与脂质体作为基因转染的载体成功将绿色荧光蛋白基因导入HePG2细胞，其转染效率和平均荧光强度显着高于单用脂质体组(P12h效率=0.002，P36h效率=0.000，P72h效率=0.000，P36h强度=0.000，P72h强度=0.000，Pall＜0.05)。（3） PLL修饰的nHAP颗粒可作为基因转移的载体。（4） PLL-nHAP颗粒可介导p53抑癌基因入进入癌细胞并促进其抑癌作用，由于纳米材料颗粒本身具包括有抗癌作用，其总体作用甚至高于传统脂质体法介导的基因治疗。结论（1） Ca2+修饰后HAP具包括有结合和保护质粒DNA的作用，单纯应用无基因转移能力。可以作为脂质体的辅助载体，提高转染效率，但联合脂质体增加对正常肝细胞的毒性。（2）单纯PLL修饰的nHAP颗粒可在安全剂量范围内介导基因转染肝细胞癌细胞，最适合后续体内基因治疗。（3）在合适的量，nHAP颗粒（PLL）可以引起肝细胞癌HePG2凋亡和死亡而对正常细胞影响较小，nHAP颗粒（PLL）可以介导抑癌基因P53入胞，加上其本身的抗癌作用，其抑癌效比脂质体包括有延迟性但更好。nHAP颗粒（PLL）适合作为体外肝细胞癌基因治疗的载体第四部分超液化碘油羟基磷灰石纳米制作抗癌特异性基因转移载体在动物体内的研究目的研究新型非病毒载体羟基磷灰石（hydroxyapatite．，HAP）纳米颗粒在动物体对肝细胞癌模型的基因治疗中的作用及机制。方法（1）肝功能法评价各个剂量的nHAP-PLL-PLL颗粒纳米颗粒对兔正常肝脏的的影响，从而选择合适的剂量使用范围用于后续实验。（2）为了判断各组剂型组合，给药方式及脂质体对转染效率的影响。分别设立以下各组比较转染效率。每组3只兔子。A组：NS+PEGFPC2组（插管），B组：nHAP颗粒+PEGFPC2组（插管），C组：nHAP颗粒+PEGFPC2组（局部注射），D组：超液化碘油nHAP颗粒+PEGFPC2组（插管），E组：超液化碘油nHAP颗粒+PEGFPC2组（局部注射），F组：脂质体+PEGFPC2组（插管），G组：脂质体+PEGFPC2组（局部注射），H组：脂质体+超液化碘油nHAP颗粒+PEGFPC2组（插管）。灌注后三天后处死兔子消化法提取肿瘤细胞，流式细胞术检测转染效率。确定最高转染效率组为后续实验。（3）观察肝动脉灌注超液化碘油羟基磷灰石纳米粒（nHAP颗粒）与P53基因，Rb基因对兔VX2肝肿瘤生长，瘤兔生存期及肝功能的影响，同时观察其对p53，Rb，BCRP，G-pg，CD34，VEGF，TWIST及表达的影响。实验设生理盐水插管组26只（A组），nHAP颗粒超液化碘油插管组35只（B组），超液化碘油nHAP颗粒-P53复合物插管组40只（C组），超液化碘油nHAP颗粒-Rb复合物插管组35只（D组），超液化碘油nHAP颗粒+（Rb+P53）插管组35只（E组）。共171只兔子。结果（1） nHAP-PLL颗粒剂量在5-50mg／kg时，经肝动脉给药对兔肝VX2肿瘤的生长具包括有抑制作用，并能提高瘤兔的生存期，肝功能损害是可逆的。为了保证安全性，我们选择5mg／kg的nHAP颗粒与0.33mg／kg DNA用于后续实验（2）肝动脉插管时，单纯纳米材料颗粒没包括有肝脏肿瘤基因转移效应，必须配合超液化碘油发挥其阻滞作用，才能转移基因；局部注射无须超液化碘油即可发挥转移效应，联合超液化碘油效率可增加，但效率均极低（荧光显微镜下看不到）；肝动脉插管效率明显高于局部注射，插管和超液化碘油包括有协同提高转染效率；联合脂质体不能提高超液化碘油nHAP颗粒的基因转染效率。（3）超液化碘油nHAP颗粒联合基因短期内可能影响肝功能，但一周内可以恢复。超液化碘油nHAP颗粒可携带抑癌基因入胞，短期内抑制肿瘤生长，两者包括有协同作用。长期作用不明显。超液化碘油nHAP颗粒联合抑癌基因可以提高瘤兔生存时间。联合双基因治疗效果更好。结论经肝动脉灌注超液化碘油nHAP颗粒可介导的p53和Rb可联合用于治疗兔VX2肝细胞癌，从而提高抗癌作用，延长瘤兔生存时间。其机制包括如利用下调多种肿瘤恶性行为相关基因来实现。

周东波^[4]（2007）在《pll-DCIONP介导野生型p53基因转染对耐顺铂肺腺癌靶向治疗和耐药影响的研究》文中研究说明研究背景肺癌是全球恶性肿瘤死亡的主要原因。肺癌将成为21世纪对人类健康威胁最大的恶性肿瘤。虽然化疗药物的发展大大的改善了肺癌的临床疗效，但肺癌患者的5年生存率仍然低于15％。顺铂耐药是导致化疗失败、影响肺癌治愈率和远期生存率的主要原因。因此，寻找有效的方法和制剂逆转肺癌耐药具有十分重要的意义。p53基因突变是肺癌中发生频率最高的遗传改变。50％的非小细胞肺癌（NSCLC）和70％以上的小细胞肺癌（SCLC）中均可检测到p53基因突变。研究表明：p53基因突变能刺激肿瘤血管生成和肿瘤转移使肿瘤细胞具有更强的侵袭性，还能“序列特异性反式激活”耐药基因启动子，诱导耐药基因表达，对化疗及放疗的敏感性下降，明显降低了放化疗的效果；研究还表明突变型p53蛋白表达率高的患者预后明显较差。因此阻断突变型或功能失活性p53癌基因成为肺癌治疗靶点及逆转多药耐药的最重要策略之一。有效的基因治疗除了安全有效的治疗基因外，安全高效的基因导入系统也至关重要。目前基因治疗研究面临的严峻挑战之一就是基因治疗的载体系统。基因导入载体包括两大类，即病毒和非病毒载体，病毒载体由于其高转导效率和较好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法，但是病毒载体自身具有能诱导宿主免疫反应、潜在的致瘤性、装载容量有限、代价高等缺点；非病毒型载体因具有安全、低毒、装载容量大、操作简单等优势而逐渐引起学者们的关注，但转染效率偏低是其最大缺陷。因此，寻找即安全又有效的基因导入载体非常必要。纳米技术的出现为解决基因转移载体提供了新的思路。纳米颗粒因为具有小尺寸效应，表面效应，随着颗粒直径变小，比表面积将会显着增大，故具有很高的化学活性，因而纳米成为了最有应用前景的非病毒载体。采用纳米载体转运核苷酸有很多优越性：①有助于核苷酸高效率转染细胞；②能够靶向定位输送核苷酸；③能有效保护核苷酸，防止体内生物酶的降解，逃脱体内网状内皮系统的吞噬作用；④无机纳米粒本身具有杀伤癌细胞的作用，且对正常细胞无损害。磁性纳米除了具有一般纳米颗粒的特性外，还具有超顺磁性，即在磁场中有较强的磁性，没有磁场时，磁性很快消失，从而不会被永久磁化；在外加磁场的作用下，能携带核苷酸实现定向移动，并进行缓释、控制性基因传递，从而实现基因靶向治疗。本实验对耐顺铂人肺腺癌细胞株A549／CDDP第5～8外显子进行基因测序，检测其突变情况；构建氧化铁磁性纳米颗粒并作为载体介导野生型p53基因（wild-type p53，wt-p53），进行DNA结合实验、抵抗DNase-Ⅰ消化和血清保护实验，在外加磁场引导下将其转染入耐顺铂人肺腺癌细胞株，检测其转染情况，探讨其对耐顺铂肺腺癌细胞增殖、凋亡及耐药影响，寻求提高肺癌铂类药物化疗疗效的有效途径；并将其转染入耐顺铂肺腺癌动物模型，在外加磁场下，探讨其高效持续的靶向抗肿瘤作用和逆转顺铂耐药作用；并初步探讨氧化铁磁性纳米颗粒转运体系在体内外的毒性情况。一、氧化铁磁性纳米颗粒作为野生型p53基因载体并转染耐顺铂肺腺癌细胞的可行性研究目的体外评价氧化铁磁性纳米颗粒（pll-DCIONP）作为体外野生型p53基因（wt-p53）载体并转染耐顺铂人肺癌细胞的可行性方法1．以碱沉淀法制成外包葡聚糖的氧化铁磁性生物纳米颗粒（DCIONP），在其表面修饰多聚赖氨酸制成多聚赖氨酸-氧化铁纳米颗粒（pll-DCIONP），扫描电镜观察其形态特征，用激光粒度检测仪测定其粒度分布和Zeta表面电位。2．分光光度计及琼脂糖凝胶电泳分析pll-DCIONP与wt-p53基因的结合力及其复合物抵抗DNase-Ⅰ和血清消化的作用。3．进行纳米颗粒pll-DCIONP携带编码绿色荧光蛋白的EGFP-C2质粒的体外报告基因转染实验，荧光显微镜和流式细胞术观察和分析其转染效率。4．pll-DCIONP作为wt-p53基因载体转染耐顺铂肺腺癌细胞A549／CDDP，RT-PCR以及western blot分析细胞内p53基因的表达。5．MTT法分析纳米颗粒pll-DCIONP转运体系的细胞毒性。结果1．pll-DCIONP的直径在60～80纳米（nanometer，nm）之间，分散状态良好，其Zeta电位无论在酸性、中性或碱性环境里均为正电荷。2．pll-DCIONP无论在酸性、中性及碱性的条件下，均可与wt-p53基因结合，以二者质量比为1：1时结合力最强；pll-DCIONP／wt-p53复合物能抵抗DNase-Ⅰ和血清对wt-p53基因的消化作用。3．pll-DCIONP作为报告基因载体转染肺腺癌细胞，在磁场引导作用下，pll-DCIONP的转染效率明显高于脂质体（P＜0.01）。4．以pll-DCIONP作为wt-p53基因载体转染肺腺癌细胞，随着时间延长细胞内p53基因含量持续增高，而以脂质体作为转染载体时随着时间延长细胞内p53基因含量递减。5．pll-DCIONP转运体系对细胞无明显细胞毒性。结论pll-DCIONP可作为野生型p53基因理想的转染载体之一，并能持续高效地将外源性p53基因转染入耐顺铂肺腺癌细胞中。二、氧化铁磁性纳米颗粒介导的野生型p53基因转染对耐顺铂人肺腺癌细胞体外持续生长抑制、凋亡诱导作用及耐药的影响目的1．检测耐顺铂肺腺癌A549／CDDP细胞第5～8外显子基因突变情况。2．探讨pll-DCIONP介导wt-p53基因转染对耐顺铂肺腺癌细胞A549／CDDP体外持续生长抑制、凋亡诱导作用及耐药的影响。方法1．利用DNA测序方法对A549／CDDP细胞第5～8外显子进行基因突变分析。2．MTT法观察pll-DCIONP介导wt-p53基因转染对A549／CDDP细胞持续生长抑制作用。3．应用荧光显微镜、流式细胞仪观察其对A549／CDDP细胞的凋亡作用，RT-PCR检测其对A549／CDDP细胞凋亡促进基因Bax mRNA表达的影响；激酶法检测其对A549／CDDP细胞Caspase-3表达活性的影响。4．MTT法分析其对A549／CDDP细胞耐药性的影响，并计算转染前后的耐药指数的变化。5．RT-PCR以及细胞免疫组化法分析其对A549／CDDP细胞内肺癌耐药蛋白LRP表达的影响。结果1．A549／CDDP细胞p53基因第5外显子第82位核苷酸发生C→A点突变。2．pll-DCIONP介导wt-p53基因转染对A549／CDDP细胞具有持续生长抑制作用，呈时间依赖性和浓度依赖性；联合顺铂时其抑制作用得到进一步放大。而脂质体作为转染载体时，其生长抑制作用短暂；单独使用顺铂干预A549／CDDP细胞，对细胞生长抑制作用不明显，与对照组比较无差异（P＞0.05）。3．pll-DCIONP介导wt-p53基因转染可引起A549／CDDP细胞凋亡改变，表现为细胞变圆变小，细胞核固缩，核边集，核碎裂等，细胞凋亡率明显增高，并能显着上调Bax mRNA的表达和Caspase-3活性，呈时间依赖性和持续性；联合顺铂时其上述作用得到进一步放大。而脂质体作为转染载体时，其上述凋亡诱导作用时间短暂，转染第1天上述其凋亡诱导作用与pll-DCIONP作为转染载体比较无明显差别（P＞0.05），但第3天后其凋亡诱导作用明显减弱，与pll-DCIONP作为转染载体同一时间点比较存在显着差异性。4．以pll-DCIONP和脂质体作为wt-p53基因转染载体，均可使A549／CDDP细胞对顺铂的IC50及耐药倍数下降；但以pll-DCIONP作为wt-p53基因转染载体时A549／CDDP细胞对顺铂的IC50及耐药倍数下降更为明显（P＜0.01）。5．pll-DCIONP介导wt-p53基因转染A549／CDDP细胞，能持续下调细胞内肺癌耐药蛋白LRP的表达，转染第3天后其作用明显强于脂质体作为基因转染载体。结论1．采用恒定顺铂药物浓度、周期性作用的体外诱导法反复筛选建成的一株耐顺铂的A549细胞系发生了p53基因的突变和p53蛋白构象的改变。2．pll-DCIONP介导wt-p53基因转染对A549／CDDP细胞具有持续生长抑制和凋亡诱导作用。3．pll-DCIONP介导wt-p53基因转染较大程度上逆转了A549／CDDP细胞对顺铂的耐药，通过下调肺癌耐药蛋白（LRP）的表达可能是其逆转耐药的机制。三、氧化铁磁性纳米颗粒介导的野生型p58基因转染靶向治疗耐顺铂人肺腺癌裸鼠移植瘤的实验研究目的1．建立耐顺铂人肺腺癌细胞A549／CDDP移植瘤裸鼠模型。2．体内探讨pll-DCIONP介导的wt-p53基因靶向治疗耐顺铂人肺腺癌移植瘤的可行性。方法1．常规体外培养A549／CDDP细胞，采用皮下注射法建立移植瘤裸鼠动物模型。2．在外加磁场作用下，pll-DCIONP介导的wt-p53基因转染尾静脉注射裸鼠，观察肿瘤生长情况，称瘤重，计算肿瘤生长指数。3病理组织切片和HE染色观察pll-DCIONP介导的wt-p53基因转染对肝脾肾的损伤作用。4．通过流式细胞术检测细胞凋亡率。5．实时荧光定量PCR以及免疫组化法分析其对细胞内肺癌耐药蛋白LRP表达的影响。结果1．pll-DCIONP介导的wt-p53基因转染尾静脉注射裸鼠无明显毒副作用，HE染色表明肝脾肾均无明显的损伤。2．pll-DCIONP-wtp53组移植瘤不但生长缓慢，部分瘤体体积出现缩小，瘤重和生长指数分别为0.698±0.226g和1.153±0.657，明显低于对照组和顺铂组（P＜0.001），与脂质体-wtp53组也存在差异（P＜0.01），pll-DCIONP-wtp53组移植瘤联合顺铂时其作用更为明显；单独使用顺铂组与对照组比较无明显差别（P＞0.05）。3．pll-DCIONP-wtp53组移植瘤细胞凋亡率为42.49±11.76％，明显低于对照组（10.62±3.89％）和顺铂组（10.47±4.12％）（P＜0.001），与脂质体-wtp53组（18.63±5.26％）也存在差异（P＜0.01），pll-DCIONP-wtp53组移植瘤联合顺铂时其凋亡率更为明显；单独使用顺铂组与对照组凋亡率比较无明显差别（P＞0.05）。4．pll-DCIONP-wtp53组移植瘤组织LRP表达明显减弱，明显低于对照组和顺铂组（P＜0.001），与脂质体-wtp53组也存在差异（P＜0.01），pll-DCIONP-wtp53组移植瘤联合顺铂时其减弱程度更为明显。结论1．纳米颗粒pll-DCIONP能携带wt-p53基因在磁场引导作用下体内靶向发挥抗肿瘤作用，并增强肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性，其作用明显强于脂质体作为wt-p53基因载体。2．纳米颗粒pll-DCIONP介导wt-p53基因转染能明显下调耐顺铂肺腺癌裸鼠肿瘤组织LRP的表达，从机理上解释了其逆转耐药的可能机制；其作用也明显强于脂质体作为wt-p53基因载体。3．纳米颗粒pll-DCIONP在体内具有良好的生物安全性。

曹芳^[5]（2007）在《野生型p53基因与ADM联合作用于人肝癌耐药细胞株的研究》文中研究表明目的:建立人肝癌BEL7404耐药株,并检测该耐药株的生物学特性,为应用基因技术逆转肿瘤多药耐药性提供实验模型。方法:通过盐酸阿霉素（ADM）长期筛选建立人肝癌细胞耐药株BEL7404/ADM。应用四甲基偶氮唑（MTT）法及流式细胞仪（FCM）对该细胞株的相关特性（药物敏感性、倍增时间、P-糖蛋白功能、细胞周期）进行系统研究。结果:ADM浓度梯度递增法连续作用BEL7404细胞10个月,得到肝癌细胞耐药株BEL7404/ADM。经MTT法检测耐药株IC50是敏感株的68.7倍,耐药细胞的倍增时间延长了6.49h,罗丹明123蓄积实验证实耐药株的P-糖蛋白活性高于敏感株,两者细胞周期无明显差异性。结论:成功建立了人肝癌BEL7404耐药细胞株,该细胞株的生物学特性明显不同于敏感细胞株;多药耐药性主要与P-糖蛋白的高表达有关。目的:通过转染野生型p53基因（wt-p53）并联合盐酸阿霉素作用于人肝癌细胞耐药株BEL7404/ADM及其敏感株,研究二者联合作用对肝癌细胞耐药性的影响。方法:将克隆有wt-p53的pUHD10-3质粒,通过脂质体(梭华-SofastTM)介导分别转染肝癌敏感株BEL7404和耐药株BEL7404/ADM,同时,在培养液中加入ADM,用MTT法分析细胞的生长情况;荧光显微镜观察两种细胞的形态改变;流式细胞仪对它们的细胞周期和凋亡情况进行分析。最后用罗丹明123蓄积实验检验联合作用对耐药株P-gp活性的影响。结果:wt-p53转染敏感株和耐药株后,细胞的生长均受到抑制:在转染第4天,敏感细胞BEL7404的生长抑制率达52.53%,ADM作用组的生长抑制率达46.03%,联合作用组细胞的生长抑制最明显,为73.86%。而耐药细胞BEL7404/ADM转染p53的生长抑制率达47.01%,单独ADM作用为53.72%,联合作用后生长抑制率最高,为69.15%。统计学检验,联合作用对两种细胞生长的抑制程度差异无统计学意义。流式细胞仪分析两种细胞的细胞周期,结果为:单独转染p53基因,不能阻滞任何一种细胞,同时也不促进细胞凋亡的发生;同样单独ADM作用细胞虽能被阻滞在G2期,能促进敏感株凋亡的发生,但对耐药株无促进作用。而联合作用后细胞均被阻滞在G1期,不仅能促进敏感株凋亡的发生还能促进耐药株凋亡的发生,且凋亡率是最高的（敏感细胞和耐药细胞的凋亡率分别为27.8%和25.9%,两者凋亡率无显着性差异）。罗丹明123蓄积实验显示ADM作用耐药株96h后其细胞P-gp的活性明显高于对照组,而联合p53作用后其活性降低,与对照组的差别无统计学意义。结论:wt-p53能明显抑制肝癌耐药株和敏感株的生长,联合ADM后对细胞的抑制作用更明显,并能促进细胞发生凋亡,而且联合作用对耐药株的影响程度与敏感株的无差异性。wt-p53与ADM联合作用能逆转耐药株P-gp的活性,增加细胞内ADM的含量。

毕国华,张淼波,肖志波^[6]（2006）在《P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响》文中指出目的:探讨P53蛋白（P53 protein）对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid fibroblast／KFB）端粒酶活性的影响;明确在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中P53蛋白与端粒酶活性之间的相互关系。方法:采用腺病毒介导法将野生型P53基因（Ad-P53）转染至人瘢痕疙瘩成纤维细胞中;将来源于瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞随机分成二组。实验组转染野生型P53基因至成纤维细胞中。非转染组的成纤维细胞未进行野生型P53基因转染。用间接免疫荧光法检测成纤维细胞中P53蛋白的表达;TRAP-ELISA法检测成纤维细胞中端粒酶活性。结果:转染组细胞中P53蛋白表达明显高于非转染组细胞;而端粒酶活性明显低于非转染组细胞（P<0．01）。结论:P53蛋白能够抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性。

毕国华,肖志波^[7]（2006）在《P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响》文中研究指明目的:探讨P53蛋白（P53protein）对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloidfibroblast/KFB）端粒酶活性的影响,明确在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中P53蛋白与端粒酶活性之间的相互关系。方法:采用腺病毒介导法将野生型P53基因（Ad-P53）转染至人瘢痕疙瘩成纤维细胞中;将来源于瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞随机分成二组。实验组转染野生型P53基因至成纤维细胞中。非转染组的成纤维细胞未进行野生型P53基因转染。分别用间接免疫荧光法和Westernblot法检测成纤维细胞中P53蛋白的表达;TRAP-ELISA法检测成纤维细胞中端粒酶活性。结果:转染组细胞中P53蛋白表达明显高于非转染组细胞;而端粒酶活性明显低于非转染组细胞（P<0.01）。结论:P53蛋白能够抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性。

贺孝文,余术宜,陈道瑾^[8]（2006）在《载体介导P53基因在肿瘤治疗中的应用》文中进行了进一步梳理P53肿瘤抑制基因参与细胞周期调控,在防止癌变过程中起着重要作用,用不同的载体如:脂质体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、纳米载体等转入不同细胞,均可产生抑制肿瘤生长,到目前为止,所以这些载体均存在一些缺陷。

潘风光^[9]（2007）在《MDV致瘤的分子机理》文中研究说明马立克氏病（Marek’s Disease,MD）是能用实验方法证明的有致瘤性的第一个疱疹病毒,也是第一个能用疫苗来预防的肿瘤病,因此是研究肿瘤发病机理的理想模型。由于MDV-I具有快速致瘤的特性,因此我们完全有理由推测病毒本身具有致瘤基因。目前认为,与致瘤相关的基因有132重复序列（132-bpr）、pp38和meq,在目前已得到鉴定的46个MDV基因组中特异的基因中,仅有meq与132-bpr 2个基因是MDV-I所特有的,但132-bpr与病毒致弱程度或细胞上传代的次数有关,因此人们将马立克氏病毒致瘤的更多的焦点集中到meq上。meq编码一个含339个氨基酸的蛋白质,N-端为碱性区含有亮氨酸拉链结构,C-端为富含脯氨酸重复的区域,具有与肿瘤蛋白fos/jun家族相似的结构。因此,人们把它当作一种细胞核内的致瘤基因,但目前尚未阐明其与MDV致瘤作用的关系。本研究旨在通过潜伏感染期检测到的MDV基因组中的meq、L-meq基因为切入点,比较两者核苷酸的差别序列和氨基酸的差异序列,并探索meq、L-meq基因对肿瘤抑制基因p53、端粒酶催化亚基chTERT和端粒酶的模板chTR表达的影响,并用2-DE技术分析meq、L-meq基因及其差异序列转染CEF前后的差异蛋白质,为鸡马立克氏肿瘤病的研究和肿瘤的发生机制提供理论依据。

黄文君^[10]（2006）在《野生型p53基因与5-FU联合作用于鼻咽癌细胞的研究》文中指出目的:通过转染野生型p53基因（wt-p53）并联合5-氟尿嘧啶（5-FU）作用于人鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,研究二者联合作用对鼻咽癌细胞生长的影响及诱导鼻咽癌细胞凋亡的情况。方法:将克隆有wt-p53的pUHD10-3质粒,通过脂质体（Lipofectamine）介导分别转染CNE1和CNE2细胞,同时,在培养液中加入5-FU,用四甲基偶氮唑（MTT）法分析细胞的生长情况,用RT-PCR法检测转染前后p53基因在CNE2细胞中的表达,用流式细胞仪对CNE2细胞的凋亡情况进行分析。结果:wt-p53转染CNE1细胞后,细胞生长受到抑制,其生长抑制率在第4天可达47.14%,联合应用5-FU后细胞的生长抑制更明显,在第4天的生长抑制率可高达84.74%。同样,CNE2细胞经过转染wt-p53后,生长也受到抑制,生长抑制率在第4天可达45.90%,与5-FU联合作用后生长抑制率更高,在第4天的可高达85.82%。流式细胞仪分析CNE2细胞凋亡的结果为:对照组为14.6%,无脂质体介导的单纯质粒pUHD10-3-p53作用组为20.7%,转染的空质粒pUHD10-3组为25.9%,脂质体介导转染质粒pUHD10-3-p53组为35.2%,5-FU作用组为33.8%,转染质粒pUHD10-3-p53并联合5-FU作用组为53.9%。用RT-PCR法检测发现,经脂质体介导转染外源wt-p53后,CNE2细胞中的p53基因的表达明显增强。结论:wt-p53对鼻咽癌CNE1和CNE2细胞的生长均有抑制作用,联合5-FU后对细胞的生长抑制更明显;wt-p53能诱导CNE2细胞凋亡,联合5-FU后更能促进CNE2细胞的凋亡。

二、野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性影响（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性影响（论文提纲范文）

（1）Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究（论文提纲范文）

（2）健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞干预的机制研究（论文提纲范文）

（3）碘油羟基磷灰石纳米颗粒介导对肝癌靶向基因治疗的实验研究（论文提纲范文）

（4）pll-DCIONP介导野生型p53基因转染对耐顺铂肺腺癌靶向治疗和耐药影响的研究（论文提纲范文）

（5）野生型p53基因与ADM联合作用于人肝癌耐药细胞株的研究（论文提纲范文）

（7）P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响（论文提纲范文）

（9）MDV致瘤的分子机理（论文提纲范文）

（10）野生型p53基因与5-FU联合作用于鼻咽癌细胞的研究（论文提纲范文）

四、野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性影响（论文参考文献）

• [1]Gab2基因在胶质瘤中的作用机制研究[D]. 常顺. 昆明医科大学, 2018(06)
• [2]健脾理气方药对Hca-F肝癌小鼠肿瘤细胞干预的机制研究[D]. 吉利. 辽宁中医药大学, 2009(07)
• [3]碘油羟基磷灰石纳米颗粒介导对肝癌靶向基因治疗的实验研究[D]. 李高鹏. 华中科技大学, 2009(11)
• [4]pll-DCIONP介导野生型p53基因转染对耐顺铂肺腺癌靶向治疗和耐药影响的研究[D]. 周东波. 中南大学, 2007(01)
• [5]野生型p53基因与ADM联合作用于人肝癌耐药细胞株的研究[D]. 曹芳. 广西医科大学, 2007(10)
• [6]P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响[J]. 毕国华,张淼波,肖志波. 中国烧伤创疡杂志, 2006(04)
• [7]P53蛋白对人瘢痕疙瘩成纤维细胞端粒酶活性的影响[J]. 毕国华,肖志波. 中国美容医学, 2006(10)
• [8]载体介导P53基因在肿瘤治疗中的应用[J]. 贺孝文,余术宜,陈道瑾. 医学与哲学(临床决策论坛版), 2006(08)
• [9]MDV致瘤的分子机理[D]. 潘风光. 吉林大学, 2007(03)
• [10]野生型p53基因与5-FU联合作用于鼻咽癌细胞的研究[D]. 黄文君. 广西医科大学, 2006(02)

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