一、caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡（论文文献综述）
韩健[1]（2021）在《Scutellarin对骨肉瘤的作用及其分子机制》文中提出背景:骨肉瘤又称成骨肉瘤,是一种起源于骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤,主要发生在20岁以下的儿童或青少年。由于骨肉瘤多数为高度恶性,在局部呈侵袭性生长且易较早的发生血行转移,故该疾病的病程进展十分迅速。目前,骨肉瘤的治疗模式通常采用术前大剂量化疗-手术切除病灶-术后继续辅助化疗。虽然,经过综合性治疗以后,多数的患者可避免截肢,改善了生活质量,且明显提高了生存率。但是,化疗药物巨大的毒副作用和肿瘤耐药性的产生仍然是骨肉瘤不良预后的主要原因。同时,带给患者本人、家庭和整个社会巨大的精神压力以及经济负担。因此,探求新的安全有效的药物对于骨肉瘤的治疗具有重要现实意义和实用价值。随着抗疟药青蒿素的问世,使得中医药在各研究领域受到广泛关注。近年来,中医药抗肿瘤活性的研究取得了突破性进展,探索出许多具有价格低廉、毒副作用小、药理活性广泛和安全性能高等优势的天然产物。黄酮类化合物是一类重要的天然植物化学物质,因其独特的化学结构而具有许多生理、生化作用。Scutellarin（SCU）,又称野黄芩苷、灯盏花乙素,是黄酮类化合物的一种活性成分,具有抗氧化、抗炎、神经保护、心脏保护等生理作用,被应用于中风、心肌梗死和脑血栓形成等多种疾病的治疗。最近的一些肿瘤研究表明,SCU在肝癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等癌症中具有抗肿瘤作用。虽然,在不同肿瘤类型中SCU都具有抗癌活性,但对于骨肉瘤的作用及其机制尚未明确。目的:本课题研究选取骨肉瘤143B、U2OS细胞为研究对象,通过一系列体内外实验观察SCU对骨肉瘤细胞产生的影响;基于表型实验的结果,借助高通量测序技术初步探讨SCU在抑制骨肉瘤细胞增殖诱导细胞凋亡方面的潜在作用机制,为骨肉瘤治疗提供新的思路以及重要的实验依据。方法与结果:1.使用浓度为0,100,200,300,400,500μM的SCU分别处理骨肉瘤143B、U2OS细胞48h,通过细胞增殖试验（MTT assay,MTT法）和集落形成实验检测细胞的增殖变化。结果表明,SCU对骨肉瘤细胞的增殖能力具有抑制作用,并呈浓度依赖性,即随着SCU的浓度增高,对细胞增殖的抑制作用越显着。2.SCU以0,300,500μM的浓度分别处理骨肉瘤143B、U2OS细胞,作用时间为48h,应用流式细胞术检测细胞凋亡、周期的变化。结果显示,随着浓度的增加,骨肉瘤细胞的总凋亡比率明显增加,同时使细胞在G2/M期的比例增加。3.使用骨肉瘤143B细胞建立裸鼠皮下荷瘤模型,通过灌胃方式连续给药12天,我们发现SCU（60mg/Kg/day）有效的抑制了小鼠皮下移植瘤的生长。同时,免疫组化结果表明,SCU能够上调凋亡相关标记物Cleaved-Caspase 3的表达,下调增殖相关标记物Ki-67的表达。此外,我们采用H&E染色在组织形态学水平验证了SCU对小鼠皮下移植瘤显着的抑制作用。4.为了研究SCU处理后骨肉瘤细胞中基因表达的变化。我们将浓度为0,500μM的SCU分别处理骨肉瘤143B、U2OS细胞48h,进行高通量测序（RNA Sequencing,RNA-seq）。结果显示,与对照组相比,加入SCU（500μM）的骨肉瘤细胞中EGR1（Early growth response protein 1）的表达量上调最为显着。随后,我们通过相同时间（48h）、不同浓度（0,300,500μM）或相同浓度（500μM）、不同时间（0,24,48h）两种方式处理骨肉瘤细胞,并采用反转录PCR（reverse transcription-PCR,RT-PCR）和蛋白印迹分析（Western Blot）检测EGR1的表达量。结果表明,随着SCU浓度的增加或时间的推移,EGR1在m RNA和蛋白水平的表达量也随之上升。这与高通量测序的结果是一致的。5.初步探究EGR1对SCU抑制骨肉瘤细胞生长的影响。首先,我们采用瞬时转染的方法将EGR1特异性siRNA（EGR1-siRNA,si-EGR1）分别转染骨肉瘤143B、U2OS细胞,沉默EGR1的表达,并通过Western Blot验证其转染效果。其次,通过MTT法、Hoechest33342核染法检测沉默EGR1的表达后对SCU抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的影响。我们将实验分为4组:（1）阴性对照组（NC组）,（2）NC+SCU组,（3）si-EGR1组,（4）si-EGR1+SCU组。Western Blot结果表明,与NC组和NC+SCU组相比,si-EGR1组和si-EGR1+SCU组的EGR1蛋白表达量均有不同程度的下降。同时,MTT法、Hoechest33342核染法的结果显示,相比于NC+SCU组,si-EGR1+SCU组中骨肉瘤细胞的增殖能力显着增强,凋亡细胞的数量明显减少。结论:本课题研究揭示了SCU在体内和体外具有抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。同时,我们借助高通量测序技术和RNA干扰技术发现SCU的抗骨肉瘤作用机制与转录因子EGR1密切相关。综上所述,我们的研究给骨肉瘤的治疗带来新的思路,并为深入探索SCU抗骨肉瘤作用机制打下坚实的基础。
陶昊[2]（2017）在《过表达Beclin 1诱导的自噬提高了MG63对Gemcitabine的抵抗与Wnt信号通路关系的研究》文中研究表明目的:Wnt/β-catenin信号传导通路异常与大多数肿瘤的发生发展有关,但Wnt/β-catenin信号传导通路在抗肿瘤化疗药物抵抗方面的作用机制仍不清楚。通过研究Beclin 1基因过表达在MG63骨肉瘤细胞自噬以及MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗中的作用,和Wnt/β-catenin信号传导通路在MG63骨肉瘤细胞自噬中的作用,探讨Wnt/β-catenin信号传导通路与Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗之间的关系。方法:1.MG63骨肉瘤细胞培养用DMEM培养液加上10%灭活的胎牛血清,在含有5%CO2的37℃培养箱中培养MG63骨肉瘤细胞,待细胞约90%融合时,在生物安全柜中进行细胞传代。加入少许0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA,消化3-5分钟,倒置显微镜下观察到胞质回缩、细胞间隙增大时,完全培养基终止消化,离心去上清（1000 rpm）,按1:3比例进行细胞传代。2.共焦荧光显微镜监测自噬将Ds Red-LC3-GFP连接到逆转录病毒载体上,与辅助质粒Gag-pol和VSVG一起共转染293T细胞,收集病毒上清后感染靶细胞。经Puromycin筛选后,建立稳定表达Ds Red-LC3-GFP的细胞株。用无血清培养基培养293T细胞3天做为阳性对照组观察自噬的发生。在共焦荧光显微镜下观察靶细胞荧光表达情况,没有发生自噬时,Ds RED红光和GFP绿光都有表达,发生自噬时,主要表现为Ds RED红光为主。3.Western blot检测在细胞蛋白抽提开始前加入0.1mol/L PMSF,1×106细胞用PBS洗两次,用含有0.1mol/L PMSF的裂解液孵育。细胞裂解物13000rpm,4℃离心20min。梯度稀释BSA标准品,配制浓度为20-2000μg/m L的待测样品。配制BCA溶液,显色反应30min,562nm测定标准液和样品的吸光度,平行测三次,计算待测样品浓度。根据待检测蛋白的分子量,配制10%的分离胶,浓缩胶浓度为4%。取待检测蛋白样品20μL上样,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转0.45μm孔径NC膜1小时,将膜完全浸没在5%脱脂奶粉-TBST中室温轻摇1小时,一抗（anti-Beclin 1和anti-LC3B）室温孵育10min,放4℃过夜,第二天取膜,在室温孵育30min,TBST洗膜5次,3min/次,用HRP标记的山羊抗兔Ig G（H+L）,室温下轻摇40min,TBST洗膜6次,3min/次。配制ECL溶液,将其滴加到膜上,室温下避光反应3-5min,选择不等时间多次胶片曝光,显影1-2min,定影。4.PCR检测Caspase 3、Caspase 7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表达取贴壁培养的呈对数生长的MG63骨肉瘤细胞约0.5×106个,培养12小时后分别给予Gem（10μg/m L）、Gem（50μg/m L）、Beclin 1+Gem（10μg/m L）、Beclin 1+Gem（50μg/m L）处理,并设立空白对照组。培养24小时后,用0.125%的胰蛋白酶消化后,PBS洗涤2次,用TRIZOL试剂提取细胞总RNA,根据操作说明合成c DNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行总RNA逆转录。5.PCR检测ATG4、Beclin 1、LAMP1、ATG5、ATG12的表达选取对数生长期的MG63骨肉瘤细胞约0.5×106个,培养12小时后分别给予Wnt3a（200ng/m L）、XAV939（1μmol/L）处理,设对照组。依次进行细胞总RNA的提取、c DNA的合成、总RNA逆转录以及检测基因引物探针的设计（方法同4）。6.流式细胞仪检测将MG63骨肉瘤细胞以1×106接种于6孔板,培养72小时后进行消化,使细胞形成单细胞悬液,2000rpm离心5min,弃去上清,用预冷的PBS洗涤2次。用100μL结合缓冲液重悬细胞,加入5μL Annexin-V染色液和5μL PI染色液,室温下避光孵育20分钟,以流式细胞仪检测细胞凋亡。7.ELISA技术分析beclin 1在MG63骨肉瘤细胞上清的水平取10μL细胞上清液用0.05mol/L Na HCO3稀释到100μL包被ELISA板,室温下振荡1.5小时。PBST洗板3次,加封闭液（PBST加1%脱脂奶粉）350μL/孔,室温下放置1小时,PBST洗3次。加封闭液稀释的胃蛋白酶原一抗100μL/孔,ELISA板于室温振荡1小时,PBST洗3次。加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100μL/孔,ELISA板于室温振荡1小时,PBST洗3次。加入OPD显色液100μL/孔,避光反应约10-30分钟。1mol/L H2SO4 100μL/孔终止反应,酶标仪测OD450nm。实验结果以均数±标准差表示,组间整体比较采用单因素/双因素方差分析,进一步采用LSD法进行两两比较检验。所有分析均在SPSS16.0软件中完成,以p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.过表达Beclin 1基因可诱发MG63骨肉瘤细胞自噬的发生过表达Beclin 1基因的MG63骨肉瘤细胞蛋白条带明显,而对照组细胞未见明显蛋白条带,差异有显着的统计学意义（p<0.05）,表明在MG63骨肉瘤细胞中成功的过表达了Beclin 1基因。过表达Beclin 1基因的MG63骨肉瘤细胞其LC3B-Ⅱ蛋白条带较对照组明显,差异有显着的统计学意义（p<0.01）,表明LC3B发生剪切,即自噬增加。2.Beclin 1过表达后可减少Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡Gemcitabine可诱导凋亡相关基因（Caspase 3、Caspase 7）的表达,下调抗凋亡基因（BCL-2,cyclin D1和c-FLIP）的表达,且呈剂量依赖性。Beclin 1基因过表达后会逆转上述过程,减少凋亡相关基因的表达。3.激活Wnt信号通路可降低MG63骨肉瘤细胞自噬,抑制可促进自噬激活Wnt信号通路可降低自噬,抑制Wnt信号通路可促进自噬。抑制Wnt/β-catenin信号通路可显着增加Beclin 1基因的表达,表明Beclin 1基因的表达可能在Wnt/β-catenin信号通路抑制自噬方面起一定的作用。4.激活Wnt信号通路可降低自噬,减少Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗Gemcitabine可以诱导MG63骨肉瘤细胞凋亡,Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞可减少Gemcitabine诱导的凋亡,激活Wnt信号通路可降低自噬,增加Beclin1基因过表达MG63骨肉瘤细胞凋亡,从而减少Beclin 1基因过表达骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗。应用Gemcitabine处理的Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞存活率呈剂量依赖性下降,在应用Gem（40μg/m L）和Gem（60μg/m L）处理的Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞中加用Wnt3a（200ng/m L）可明显降低细胞存活率,差异有显着的统计学意义（p<0.01）,而加用XAV939（1μmol/L）可明显提升细胞存活率,差异有显着的统计学意义（p<0.01）。实验结果表明,Wnt信号传导通路通过下调Beclin 1基因的表达抑制MG63骨肉瘤细胞的自噬,降低Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡。结论:Beclin 1基因过表达可诱发MG63骨肉瘤细胞自噬的发生,并减少Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡。Beclin 1过表达后可减少Gemcitabine诱导的凋亡,但Wnt信号通路激活可反向抑制。我们的研究结果为解决抗肿瘤化疗药物耐药性的问题提供了一个新的见解。Wnt/β-catenin信号通路异常可以促进Beclin1介导自噬,从而阻止化疗药物诱导的细胞凋亡。我们的研究结果为通过调节异常Wnt/β-catenin信号通路相关自噬和自噬基因Beclin 1,提高化疗药物对肿瘤细胞凋亡的敏感性提供了一种潜在的证据。
张在鹏[3]（2016）在《日本鳗鲡Caspase6基因的克隆和表达分析》文中研究表明本研究首次获得了日本鳗鲡（Anguilla japonica）Caspase6基因cDNA全长序列,命名为AjCasp6（GenBank号KJ726738）。该基因全长为1524 bp,其中开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为903 bp,编码300个氨基酸。其蛋白三维空间结构图与人类Caspase6十分相似,具有Caspase家族典型的CASc结构域,包括一个P20结构域（54aa-178 aa）和一个P10结构域（204 aa-298 aa）,半胱氨酸活性位点“KPKIFIFQACRG”及组氨酸活性位点“HADADCFVCVFLSHG”。同源性分析显示AjCasp6氨基酸序列与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相似性最高,为75%,与其他鱼类相似性在61%75%之间。系统发育树表明,AjCasp6与其他鱼类Caspase6聚为一支,而哺乳类以及两栖类Caspase6聚为一支。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明:AjCasp6基因在日本鳗鲡各组织中均有表达,其中鳃中表达量最高,肠、肝脏、肾脏、皮肤和血细胞中也有较高表达,而心脏和肌肉中的表达水平则相对较低。日本鳗鲡经LPS、poly I:C和嗜水气单胞菌（A.hydrophila）刺激后,对其肾脏、肝脏、脾脏以及血细胞中AjCasp6基因在不同时相的表达变化进行了研究。结果表明:经LPS刺激后,AjCasp6基因在肝脏、肾脏和脾脏中的表达水平均有明显升高,而血细胞中表达量仅在3 h有所升高,但6 h则显着降低;poly I:C免疫注射后,肾脏、肝脏和脾脏中AjCasp6的表达量均有显着升高,而血细胞发现在6 h显着下降,12 h表达量略有升高;嗜水气单胞菌感染后,AjCasp6基因表达量在肾脏和肝脏显着上升,但在脾脏和血细胞中的表达量仅在6 h和48 h有所提高。研究了日本鳗鲡肝脏细胞经LPS、poly I:C、CpG、PGN以及三种不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的AjCasp6基因表达水平变化,结果表明:肝脏细胞经LPS、poly I:C和PGN刺激后,AjCasp6基因表达水平均有显着升高,而经CpG处理48 h后AjCasp6表达量显着降低。经浓度分别为106 cfu/mL、107 cfu/mL以及108 cfu/mL的嗜水气单胞菌感染后,AjCasp6表达量均有显着提高,其表达量与菌体浓度的增加呈正相关。进行了日本鳗鲡AjCasp6基因原核表达及其兔抗血清的制备,结果表明:构建的重组载体pGEX-4T-2-Aj Casp6可以在大肠杆菌中高效表达,重组蛋白的分子量约为60 kDa,其表达量随着诱导时间的延长而提高,经镍柱亲和层析后获得高纯度的AjCasp6重组蛋白,制备相应的兔抗血清经ELISA检测其效价高达52100。日本鳗鲡肝脏组织通过原代培养成功使细胞从组织块中迁出,且至传代培养中获得的肝脏细胞经多次传代以后细胞形态、增殖周期渐渐稳定。由于日本鳗鲡肝脏细胞独特的生长特性,因此其可以较长时间处于生长的平台期,在不更换培养液的情况下能够维持一个月而不至于大批细胞凋亡、解体,使用时直接消化传代即可用于后续实验。构建了日本鳗鲡AjCasp6绿色荧光融合蛋白表达载体pEGFP-N1-Aj Casp6,通过转染HEK-293T细胞对该蛋白的细胞定位进行了研究。结果表明,AjCasp6蛋白仅在细胞质中有所分布,作为对照的pEGFP-N1空载体转染HEK-293T细胞后,绿色荧光蛋白在细胞核和细胞质中均有表达,提示AjCasp6主要在细胞质中参与细胞凋亡进程的调控作用。
陈楷,吕书军,付东,李国东,蔡郑东[4]（2015）在《骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展》文中提出骨肉瘤是骨科临床最常见的一种严重危害人类健康的恶性骨肿瘤,好发于青少年。常伴随截肢、肺转移、死亡等后果,其单纯手术治愈率仅15%20%[1]。随着新辅助化疗的发展,骨肉瘤患者5年生存率已提高至70%左右[2]。凋亡异常以及耐药性的产生（尤其是多重耐药性）导致肿瘤迅速进展是骨肉瘤治疗失败的主要原因[3-4]。调控细胞凋亡异常,降低骨肉瘤的耐药性,从而提高骨肉瘤治疗效果,是降低骨肉瘤死亡率,改善患者远期预后的重
周本根[5]（2014）在《Immunocasp-6融合基因对HER2过表达骨肉瘤的特异、高效性抑制作用》文中认为研究背景骨肉瘤是一种好发于青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤,其突出的特点是转移早,在临床做出诊断时,已经有80%的患者发生了肺部转移。近几十年以来,骨肉瘤的治疗有了长足的进展,近80%的患者能够保留患肢,而且5年生存率由20%提高到80%,但是仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的复发和转移。对于骨肉瘤的治疗仍然有许多的难点和疑点,因此需要探索更有效、更低毒性的治疗途径。近十年来肿瘤的基因治疗、免疫治疗和分子靶向治疗已经成为当前临床骨肉瘤研究的热点,探索新的、更加有效的治疗方法已经成为了骨肉瘤研究的重要方向。在此我们描述一个由HER2抗原特异性e23sFV单链抗体、一个单链Pseudomonas exotoxin A和一个能够直接劈裂核纤层蛋白A（lamin A）导致细胞发生程序性死亡的活性caspase-6所组成的immunocasp-6融合基因所执行的实验。人表皮生长因子受体2（HER2）,属于表皮生长因子受体家簇成员之一,在细胞信号转导过程中发挥重要作用,是细胞生长、分化以及存活的重要调节者。充足的证据已经表明HER2抗原过度表达的肿瘤患者对传统的治疗呈现一个比较差的预后。HER2抗原已经被报道在人类好几种恶性肿瘤细胞表面过度表达,包括人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤。因为其在恶性肿瘤细胞表面过度表达而在正常细胞表面很少表达或者不表达,因此在分子水平上探索正常细胞和恶性肿瘤细胞差异性上HER2抗原已经成为了一个理想的基因治疗的靶向性分子。Caspases是哺乳动物传导凋亡信号和导致细胞发生凋亡的主要成分,在细胞发生程序性凋亡的过程中Caspase-6是最有效的效应Caspases之一,活性Caspase-6通过劈裂底物核纤层蛋白A （lam in A）以及其他亚基来引导凋亡的发生。跟野生型的酶原衍生物不一样,活性的Caspase-6由顺序相反的两个亚基组成,能够在体外独立地自动地传导凋亡信号,诱导细胞发生凋亡,这一特点使得活性Caspase-6成为基因治疗过程中非常有潜力的效应分子。Pseudomonas exotoxin A （PEA）是由三个大的结构域（Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ）所组成的单链毒素,结构域Ⅰ负责将分子结合到靶细胞,结构域Ⅱ负责把分子转位到胞质,结构域Ⅲ负责导致细胞发生死亡。PEA的结构域Ⅱ已经被报道能够高效地将细胞的毒性结构域转位到细胞质。用活性的Caspase-6替代PEA的结构域Ⅲ,我们旨在将效应Caspase易位至肿瘤细胞质中,让它诱导肿瘤细胞发生凋亡。作为一个被公认的抗体,e23sFV单链抗体起源于鼠抗人HER2单克隆抗体,被确认对HER2细胞外区域有高度亲和性,并且能够通过细胞的胞吞作用而内入细胞。抗原抗体反应的高度特异性暗示着我们所构建的immunocasp-6融合基因中的e23sFV单链抗体能够特异性地识别过度表达的恶性肿瘤细胞表面的HER2抗原,在PE结构域Ⅱ的介导下将immunocasp-6融合基因转位至肿瘤细胞质中,由活性Caspase-6劈裂底物核纤层蛋白A （lamin A）以及其他亚基来引导凋亡的发生,从而特异、高效性抑制HER2抗原过度表达的恶性肿瘤。虽然这一新奇的immunocasp-6融合基因已经被证明能够特异、高效性诱导HER2抗原过度表达的人乳腺癌SKBR3细胞发生凋亡,但是是否能够特异、高效性诱导人骨肉瘤细胞发生凋亡仍然不清楚。因此本研究的目的是延伸immunocasp-6融合基因的对HER2抗原过表达恶性肿瘤的治疗策略,在体外、体内试验中验证immunocasp-6融合基因对HER2抗原过度表达骨肉瘤的特异、高效性抑瘤效果。材料与方法质粒和DNA构建我们通过序列融合信号肽基因（Met-Lys-His-Leu-Trp-Phe-Phe-Leu-Leu-Leu-Val-Ala-Ala-Pro-Arg-Trp-Val-Leu-Ser-）构建了一个重组型的immunocasp-6融合基因（由PE结构域Ⅱ的NH2终末端融合抗HER2抗原的单链抗体（e23sFv）以及PE结构域Ⅱ的COOH终末端融合重组Caspase-6所构成图2-2）。Immunocasp-6融合基因然后被克隆入pCMV质粒中,构建成pCM V-immunocasp-6。细胞培养人骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞系具有高度远处转移潜力,它来自一个17岁的男性病人,他被诊断为胫骨骨肉瘤,并且接受了截肢手术,并在体外经过1年时间、连续120代传种接代所建立的骨肉瘤细胞系。骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞被保存于DMEM or RPMI-1640（Invitrogen）细胞培养基中生长,这些培养基不断补充10%胎牛血清（FBS）和4mmol/1的L-谷氨酰胺。骨肉瘤细胞表面HER2抗原的检测待骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长至一定数目后,以鼠抗人HER2单抗作为一抗,按标准程序进行间接免疫荧光染色检测以及流式细胞术检测；骨肉瘤组织来自于全军骨肿瘤研究82例骨肉瘤患者,肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,进行HER2抗原的SP法免疫组织化学染色,具体操作过程参照Vectastain Elite ABC kit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。细胞的瞬时转染转染前24小时,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞以1×105或5×105/孔种植于96或12孑costar transwell平板中,lug pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与2ul Lipofectamine2000（Invitrogen）混合,室温下孵育20分钟形成DNA-liposome混合物,接下来混合物接种于骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞中,并在湿润孵化器37℃、5%CO2条件下继续孵育6h,然后培养基被移去,细胞被重新悬浮生长在完全培养基中。细胞生存能力分析瞬时转染的肿瘤细胞的生存能力通过3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazo-lium bromide （MTT）方法检测。简单来说,等骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞粘附到96孔costar transwell平板底时完全随机分为三组,即正常细胞组,pCMV空载体治疗组及pCMV-immunocasp-6治疗组。用阳离子脂质体包裹pCMV-immunocasp-6或是pCMV空载体按照上述方法进行转染。转染后的骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞继续在96孔costar transwell平板内培养12-96小时,分别于转染以后的不同时间点（12、24、36、48、60、72、84、96h）吸弃培养液,于每孔内加入20ml1.5mg/ml MTT液后继续孵育4h,此后,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞用150μl DMSO溶液处理,TECAN光吸收酶标仪上测定各孔490nm波长光密度值。每个试验都在至少三个独立的场合进行了三次检测。流式细胞术检测细胞的凋亡骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞以1×05/孔密度接种于装有载玻片的12孔costar transwell平板上,当骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长至3×105/孔时用阳离子脂质体包裹pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体按照上述方法进行瞬时转染,转染后的第48小时收集载玻片上的细胞,具体操作方法按照标准程序进行Annexin V-FITC/PI染色,并最后用流式细胞仪进行分析。免疫荧光检测骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染后在完全培养基中继续培养48小时,待细胞爬片以后以40g/L多聚甲醛固定,用含有0.1%Triton X-100PBS溶液进行透化处理,接着以30ml/L H2O2灭活内源性过氧化物酶,再以二抗同源的正常动物血清进行封闭,依次加入一抗、荧光二抗、DAPI染核,封片后直接以荧光显微镜观察并照相。电子显微镜分析骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染48h后用2.5g/L的胰酶消化成为单个细胞,离心收集细胞,用2%戊二醛4m1在4℃固定30min-2h,依次用不同浓度的丙酮溶液进行脱水,用明胶囊包埋,制备成半薄切片、超薄切片,加入醋酸双氧铀染色液染色,透射电镜观察并照相。免疫细胞化学技术检测骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞转染后按上述方法在载玻片上继续培养,到适当数量后用新鲜准备的多聚甲醛溶液在室温下固定30分钟,用0.1%Triton X-100在冰上通透15分钟。样本用山羊抗人Caspase-6多抗作为第一抗体（C20,1:200; Santa Cruz Biotechnologies）检测,生物相关的抗兔抗体IgG（1:100; Santa Cruz Biotechnology）作为第二抗体,然后遵照Vectastain Elite ABCkit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。Immunocasp-6难体内抗肿瘤活性6-8周BALB/C裸鼠购自国际啮齿类实验室动物资源部上海分公司,饲养和使用遵照机构的指南。裸鼠皮下接种2×106骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞,待肿瘤自由生长至直径5-7mm大小时,裸鼠被完全随机分为两组：pCMV-immunocasp-6治疗组或pCMV空载体治疗组。荷骨肉瘤SOSP-9607-E10肿瘤的裸鼠分别于右后肢肌肉注射脂质体包裹的pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体（pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与脂质体按10ug：20u1比例进行混合）,每组使用9只裸鼠,每只裸鼠每隔3天注射一次,共5次,观测肿瘤的体积、裸鼠的重量,2周后处死全部裸鼠,仔细剥离裸鼠身上肿瘤,并记录肿瘤的纯重量,所有数据（肿瘤的体积、裸鼠的重量以及肿瘤的纯重量）采用统计学软件进行分析。HE（苏木精-伊红）染色裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,在进行染色前对石蜡切片脱蜡至水,用苏木精染色10min,然后用水冲洗,在盐酸酒精中浸泡10min,用流水冲洗,逐渐脱水,用伊红染色5min,脱水至透明,封片后用倒置显微镜观察并照相。TUNEL染色裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,石蜡切片经脱蜡、透明、水化后,具体步骤按试剂盒TdT-FragELTM DNA Fragmentation说明书进行操作,并用苏木精进行复染色。免疫组织化学技术检测裸鼠处死后肿瘤组织用多聚甲醛固定制作成石蜡切片,组织切片经脱蜡、水化后,用0.3%甲醇-H202孵育20分钟去掉内源性过氧化物酶,接着烘干这些组织,用适当的血清在湿化箱内阻断1小时,添加一抗4℃过夜。样本用山羊抗人Caspase-6多抗作为第一抗体（C20,1:200; Santa Cruz Biotechnologies）检测,生物相关的抗兔抗体IgG （1:100; Santa Cruz Biotechnology）作为第二抗体,然后遵照Vectastain Elite ABC kit试剂盒操作说明每一个步骤进行,处理完后用Olympus Eclipse E600显微镜照相并行图像处理。评价immunocasp-6对人骨肉瘤肺部转移的影响18只6-8周BALB/C裸鼠购自国际啮齿类实验室动物资源部上海分公司,饲养和使用遵照机构的指南。于胫骨骨髓腔接种2×105骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞,裸鼠随后完全随机分为两组,9只裸鼠为一组,分别按上述方法于裸鼠右后肢肌肉注射脂质体包裹的pCMV-immuno casp-6或pCMV空载体（pCMV-immunocasp-6或pCMV空载体与脂质体按10ug：20u1比例进行混合）,前两周每3天一次,其后每周一次,共5周,让裸鼠自然死亡,记录裸鼠的生存期,裸鼠死亡后肺内肿瘤新生物解剖出来后计数并进行HE（苏木精-伊红）染色诊断。统计分析所有数据以均数±标准差的形势表达,数据结果采用SPSS13.0统计软件（SPSS, Chicago, IL）进行处理,细胞活力采用方差分析（ANCOVA, dunnett T3）,肿瘤的体积、裸鼠的重量及肿瘤的纯重量采用两个独立样本t检验（肿瘤的体积、裸鼠的重量数值为治疗前后差值）分析,生存曲线采用Kaplan-Meier method分析,治疗组之间的比较通过对数秩和检验（Log-rank）法得到。统计学意义是基于P<0.05的值。结果Immunocasp-6融合基因在体外实验中能够特异、高效性抑制骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞生长XU等人已经研究证明immunocasp-6融合基因能够特异性识别HER2抗原过度表达的乳腺癌细胞,内化进入细胞后,在PEA Arg279and Gly280之间进行自动切割作用,由caspase-6诱导肿瘤细胞发生凋亡,而对HER2抗原不表达的细胞无杀伤作用。为了研究pCMV-immunocasp-6能否在HER2抗原过度表达的骨肉瘤细胞上发挥同样的促凋亡的效果,我们先通过3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazo-lium bromide （MTT）法验证骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞瞬时转染后细胞的生存活力,研究结果表明瞬时表达的immunocasp-6融合基因能够导致细胞生存活力明显降低,pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞的生存活力比正常组、pCMV空载体治疗组差pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞与正常细胞组之间有统计学意义差别（P=0.013）, pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤细胞与pCMV空载体治疗组之间有统计学意义差别（P=0.007）,而正常细胞组肿瘤细胞与pCMV空载体治疗组之间没有统计学意义差别（P=0.989）。骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞瞬时转染后第48小时进行Annexin V-FITC染色检测显示pCMV-immunocasp-6组的细胞凋亡率为31.4%,而pCMV空载体组的细胞凋亡率为6%。在pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞转染后生长缓慢的同时,我们对转染后的肿瘤细胞形态学变化进行了测试。免疫荧光染色检测发现pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞出现核浓缩,核碎裂；透射电子显微镜发现pCMV-immunocasp-6组肿瘤细胞呈现典型的凋亡现象,包括染色体凝聚,异染色体边集,细胞核浓缩,出泡,形成所谓的凋亡小体；而且,免疫细胞化学染色检测进一步显示凋亡细胞中大部分Caspase-6的表达,暗示着Caspase-6在导致细胞发生凋亡的过程中发挥了积极作用。Immunocasp-6融合基因在体内实验中能够特异、高效性抑制骨肉瘤生长在脂质体包裹的pCMV-immunocasp-6治疗组中,骨肉瘤的生长明显慢于脂质体包裹的pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别（t=3.177,P=0.006）,pCMV-immunocasp-6治疗组中裸鼠的体重明显重于pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别（t=-5.153, P=0.001）, pCMV-immunocasp-6治疗组中肿瘤的纯重量明显轻于pCMV空载体治疗组,它们之间有统计学意义差别（t=5.407,P=0.001）,接着裸鼠处死后的肿瘤组织收集进行HE（苏木精-伊红）染色,HE（苏木精-伊红）染色结果表明pCMV-immunocasp-6治疗组肿瘤组织呈现比较差的生长条件,大部分细胞死亡,而pCMV空载体治疗组肿瘤组织细胞生长良好。末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术（TUNEL）进一步证明pCMV-immunocasp-6治疗组中肿瘤组织中大多细胞呈现凋亡的状况,而pCMV空载体治疗组肿瘤组织细胞生长良好。此后,免疫组织化学染色在pCMV-immunocasp-6治疗组中证实了肿瘤组织中Caspase-6的表达,而在pCMV空载体治疗组和肌肉组织（不管是pCMV-immunocasp-6治疗组还是pCMV空载体治疗组）中均未见Caspase-6的表达。这些数据暗示着immunocasp-6在体内能够特异、高效地促使HER2抗原过度表达的骨肉瘤细胞凋亡。Immunocasp-6在体内实验中对HER2过度表达的骨肉瘤肺部转移的抑制作用待裸鼠自然死亡后,解剖裸鼠肺部的新生物,进行HE（苏木精-伊红）染色诊断结果证明为骨肉瘤。在pCMV-immunocasp-6治疗组中肺内新生物的数目明显少于pCMV空载体治疗组。与此同时,pCMV-immunocasp-6治疗组裸鼠的生存期明显长于pCMV空载体治疗组。在缺乏immunocasp-6融合基因治疗作用的前提下,骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞有更高的肺转移可能,暗示着immunocasp-6能够阻止骨肉瘤肺部转移的发生。结论体外、体内实验结果表明：immunocasp-6能够特异、高效性识别、结合骨肉瘤SOSP-9607-E10细胞表面的HER2抗原,被内吞入细胞后,对细胞底物进行识别切割,执行促使细胞发生凋亡的功能,而对于HER2不表达或者低表达的组织无明显杀伤与损伤作用。从此可以看出,我们所构建的immunocasp-6融合基因中e23sFv单链抗体仍然保持了其对HER2过度表达肿瘤细胞的靶向性识别与结合能力,与此同时与抗体融合以后的重组型Caspase-6的促凋亡活性也未受到影响。与一般所构建的免疫毒素分子不同,Caspase-6是细胞凋亡途径过程中共同的末端效应蛋白酶,是细胞发生凋亡的直接执行者,所以,我们所构建的融合基因必然能够更加高效性促进HER2过度表达的肿瘤细胞发生凋亡而且不会杀伤正常无辜的细胞。此外,由于immunocasp-6融合基因主要是由人源化抗体e23scFv以及人类自身的蛋白Caspase-6分子构成,其免疫原性低,能够反复使用,由此建立了一种持续、特异、高效、安全的治疗方法,为HER2过度表达的骨肉瘤治疗治疗提供基础。
王燕燕[6]（2013）在《片叶苔素D及其衍生物抗肿瘤机制的研究和鼠李糖受体的发现》文中研究表明植物药一直是天然药物的重要组成部分,也是人类防病治病的主要来源。恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势,并且临床上肿瘤耐药时有发生,促使人们将希望寄托于寻找新型的天然抗肿瘤药物,以期发现疗效更好或具有新靶点的化合物。目前为止,世界上许多国家对抗肿瘤新药的研究投入大量的人力和财力,自然界数以百万计的植物、动物、微生物、海洋生物是新药研发的重要源泉。苔藓植物属于高等植物中较低的类别,多数生长在阴暗潮湿的环境中。在植物界的演化进程中,苔藓植物代表着从水生逐渐过渡到陆生的类型,依据形态可分为苔纲（Liverworts）、藓纲（Mosses）（?）角苔纲（Hornworts）3类。苔藓植物含有丰富的次生代谢产物,以萜类和酚类化合物为主,具有广泛的生物学活性。双联苄类化合物是苔藓植物中的一类特征性的组分,近年来的研究表明,双联苄类化合物具有多种生物学活性,包括抗肿瘤、抗细菌、抗真菌等。Riccardin D （RD）是一种双联苄类化合物,目前已经发现其在多种肿瘤细胞中诱导细胞凋亡,然而具体机制还有待进一步研究。另外,RD除了引起细胞凋亡,是否诱导其他类型的细胞死亡如自噬性死亡还没有被证实。在本论文中,我们研究了RD在人类成骨肉瘤U2OS （p53野生）和Saos-2（P53缺失）细胞中诱导细胞死亡的方式和机制。MTT方法揭示RD引起成骨肉瘤细胞U20S和Saos-2浓度和时间依赖性的死亡,而对人类正常成骨细胞则毒性很小。用PI染色流式细胞仪检测发现,RD导致U20S和Saos-2细胞阻滞在G0/G1期；Western blot方法检测RD对细胞周期蛋白的影响,发现RD在两种细胞中都能引起cyclin D和cyclin E这两种G1期蛋白表达水平的下调和细胞周期蛋白抑制剂p21WAF1的上调,同时在U20S细胞中诱导p53表达水平的增加。在p53抑制剂存在的情况下,RD仍然导致U20S细胞G0/G1期阻滞。细胞周期阻滞往往伴随着细胞凋亡,DAPI染色显示RD诱导成骨肉瘤细胞核固缩,断裂；Annexin V/PI双染并用流式细胞仪测定了细胞的凋亡率；Western blot显示RD能够引发caspase依赖的凋亡,同时伴有Bax的降低和Bcl-2的增加。进一步的研究表明,p53抑制剂不影响RD促进凋亡的作用,而caspase抑制剂能够部分逆转RD诱导的凋亡,这表明RD在成骨肉瘤细胞中介导p53非依赖而caspase部分依赖的凋亡。除了细胞凋亡,RD在成骨肉瘤细胞中引起自噬,表现为LC3B-Ⅱ的积累,AVOs的形成,LC3B-Ⅱ焦点和自噬流的增加。自噬阻断剂3MA和E64d能够抑制自噬的过程,明显减弱RD介导的细胞死亡,敲除自噬形成时的一个重要蛋白ATG5的内源性表达也能够抑制自噬流的形成。此外,自噬和caspase的抑制剂联合用药能够明显减少细胞的死亡率。综上所述,RD在成骨肉瘤细胞中同时诱导细胞凋亡和自噬。对于RD抗肿瘤活性的研究取得了初步的进展,然而RD活性中等,这促使我们对其进行修饰合成一系列衍生物以提高生物学活性,并发现更有效的抗癌药物。在各种衍生物中,氨甲基化的产物riccardin D-N （RD-N）（?）舌性较好可以作为一种潜在的候选抗癌药。为了探讨RD-N作用的药理学和分子生物学机制,首先用MTT法对其细胞毒活性进行了检测,RD-N对多种肿瘤细胞都具有抑制活性,其中对前列腺癌PC3的作用比较显着,而对正常细胞则毒性较小,说明RD-N对细胞作用具有选择性。因此,对RD-N机制的研究我们选择前列腺癌PC3、DU145和LNCaP细胞。Annexin V/PI双染并用流式细胞仪测定RD-N对PC3、DU145和LNCaP细胞的凋亡率,,western blot检测凋亡的标志蛋白PARP的剪切,这两个实验说明了RD-N能够诱导前列腺癌细胞凋亡。对于RD-N能否破坏细胞膜,我们采用LDH酶活的测定和PI荧光染色法来评价,实验结果表明RD-N对PC3细胞膜能诱导通透性增加的作用。细胞内ATP的水平随着加药浓度的升高而降低,而ATP的耗竭是细胞凋亡转变为坏死时的一个标志,以上结果说明RD-N同时能够诱导前列腺癌细胞发生坏死。此外对RD-N的亚细胞分布进行了研究,采用蔗糖密度梯度超速离心分离溶酶体和线粒体并且利用HPLC测定化合物在细胞器中的累积,发现在PC3细胞中,RD-N能优先累积于溶酶体内。RD-N累积于溶酶体后,促使溶酶体体积增大,容易发生溶酶体透化作用（LMP）。为了检测RD-N是否引起LMP,我们采用溶酶体的两个特异性探针Lysotracker Red和AO,通过流式细胞仪测定荧光强度,发现RD-N在3种前列腺癌细胞中均产生LMP作用。溶酶体发生LMP后释放组织蛋白酶（cathepsin）入细胞质,cathepsin B的抑制剂而不是cathepsinD和L的抑制剂能够明显逆转RD-N诱导的细胞死亡。另外,RD-N能够通过降低tubulin和（?）ctin的表达而影响细胞骨架系统,使细胞周期阻滞在G2/M期。体内实验表明,RD-N对裸小鼠前列腺癌移植瘤模型有明显的抑瘤作用,H&E和’TUNEL染色显示RD-N是通过引起细胞凋亡的作用机制抑瘤。因此,RD-N体外通过溶酶体损伤诱导细胞死亡,体内能够抑制肿瘤生长。RD-N引起溶酶体膜透化作用释放cathepsin B促使肿瘤细胞死亡,然而cathepsin B具体的作用机制尚未阐明,需要进一步的研究。通过PI或TUNEL染色发现,用小干扰RNA （siRNA）干扰内源性cathepsin B的表达能够明显减少RD-N引起的细胞死亡和染色质溶解,而转染cathepsin B的表达质粒使其过表达则能够促进RD-N引起的细胞死亡和染色质溶解。进一步的实验发现,PC3细胞经过RD-N处理后cathepsin B首先从溶酶体中释放出来然后进入细胞核,整个过程中蛋白表达增加,酶活性增高。RD-N诱导细胞死亡的过程中,同时有DNA损伤的发生,表现为ATM/ATR通路的激活,下游chk2和chkl分别磷酸化,损伤蛋白H2AX和修复蛋白BRCA1的磷酸化。为了寻找cathepsin B引起细胞死亡的下游作用靶点,我们应用激光共聚焦共定位、蛋白-蛋白对接、免疫共沉淀和小干扰RNA等方法,发现cathepsin B进入细胞核以后和BRCA1相互作用并降解BRCA1蛋白,干扰DNA修复的过程,促进RD-N引起的DNA损伤。对于从中药茄属类植物龙葵中分离得到的甾体生物碱类化合物solamargine, solasonine, solasodine和合成的solasodine的两个衍生物抗肿瘤活性的研究,我们发现鼠李糖部分在诱导细胞死亡中起着至关重要的作用,而包含两个鼠李糖基的化合物solamargine表现出最强的抗肿瘤活性。进一步的实验显示,solamargine对不同肿瘤细胞株也表现出不同的细胞毒作用,PC3和KB细胞比HT-29和MCF-7对solamargine更敏感。为了确定皂苷中的糖基如何发挥作用,我们设计合成了生物素化的马铃薯三糖,鼠李糖和葡萄糖与链霉亲和素键合的量子点结合,与肿瘤细胞共同孵育,发现鼠李糖探针和三糖探针的在细胞膜上的红色荧光比葡萄糖探针的荧光强。我们已经知道,鼠李糖对鼠李糖结合受体有高度的亲和性,因此,我们证明了肿瘤细胞膜表面的RBL受体在介导皂苷的抗肿瘤活性方面发挥着重要的作用。通过生物素化的糖和链霉亲和素键合的量子点结合,我们建立了一种原位观察肿瘤细胞膜表面鼠李糖结合凝集素的方法,并且第一次用这种方法观察到了RBL受体。根据该方法,我们检测了不同肿瘤细胞膜表面RBL受体的表达,发现不同的肿瘤细胞或组织有不同的RBL受体的表达,RBL受体高表达的肿瘤细胞对皂苷更为敏感。不同肿瘤细胞表面不同RBL受体表达水平的研究为肿瘤的诊断和药物敏感性研究提供了基础。此外,鉴于鼠李糖在药物吸收中的重要作用,许多化疗药物可以结合鼠李糖,以增加药物的摄取和定位。本论文首次报道了RD除了引起细胞凋亡还能诱导自噬性死亡。为了提高RD的作用效果,合成了新的衍生物RD-N,并证明RD-N是一种靶向溶酶体的药物,通过溶酶体透化作用诱发肿瘤细胞发生凋亡和坏死：溶酶体通透性增加后释放cathepsin B进入细胞核,降解BRCA1同时促进DNA损伤,这是本文发现的cathepsin B的一个新功能。论文还对肿瘤细胞表面的RBL受体进行了研究,发现不同的肿瘤细胞存在不同的RBL受体的表达,RBL受体高表达的肿瘤细胞对solamargine更为敏感,为肿瘤的诊断和药物敏感性研究提供了基础。
张锡宇[7]（2012）在《甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞G1期停滞的分子机制研究》文中研究说明成骨肉瘤发生率相对较低,但在原发性恶性骨肿瘤中占首位。该病在青少年中发病率高,且死亡率和致残率高,严重影响青少年健康。成骨肉瘤对放射治疗不敏感,目前采用大剂量化疗结合手术治疗的方式。然而化疗药物易产生耐药性且有毒副作用,因此从天然化合物中筛选低毒、高效的抗癌药物用于临床治疗具有重要意义。苄基异喹啉类生物碱（benzylisoquinoline alkaloid, BA）是自然界中广泛存在的一类生物碱,具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒及抗血小板凝集、抗心律失常和抗高血压等心血管疾病的多种药理活性。研究表明多种BA对不同肿瘤细胞株均显示了较强的细胞毒作用。其抑制肿瘤细胞增殖的机制主要是诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。甲基莲心碱（Neferine）属于双苄基异喹啉类生物碱,是莲子心（睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn）成熟种子的绿色胚芽）中一种主要的生物碱成分。已有的研究表明甲基莲心碱具有降血压、抗氧自由基、抗心律失常、抗血小板凝集等多种药理作用；并且甲基莲心碱还是一种化疗增敏剂,能逆转肿瘤细胞的多药耐药性。化疗药物抑制肿瘤细胞生长的普遍机制在于抑制其细胞周期进程和／或促进细胞凋亡。本课题组的前期研究发现,甲基莲心碱能明显抑制人类成骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞及宫颈癌细胞的生长。甲基莲心碱可诱导成骨肉瘤细胞G1期细胞周期停滞,cyclinE表达水平降低、p21蛋白水平升高,但并不引起细胞DNA损伤和细胞凋亡。然而,由于对甲基莲心碱抑制肿瘤细胞生长的分子生物学机制尚未见报道,这在一定程度上限制了其在临床医学中的应用,因此深入探讨甲基莲心碱抑制人成骨肉瘤细胞生长的可能的作用机制就有重要的意义。为进一步明确甲基莲心碱诱导成骨肉瘤细胞发生G1期停滞的分子机制,我们进行了以下的研究：●甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞细胞周期G1期停滞依赖于p21蛋白的累积由于前期研究结果提示甲基莲心碱诱导成骨肉瘤细胞G1期停滞、p21蛋白累积,因此有必要验证p21蛋白累积是否是甲基莲心碱引起成骨肉瘤细胞G1期阻滞的直接原因。1.我们采用siRNA干扰p21基因表达的方法,检测甲基莲心碱处理后U20S细胞内p21表达情况和细胞增殖能力。结果发现：与对照细胞相比,低表达p21基因的细胞经甲基莲心碱处理后,p21蛋白的累积明显减弱,并部分抵消甲基莲心碱引起的S期细胞比例降低的效应,这表明甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞细胞周期G1期停滞依赖于p21蛋白的累积。2.进一步明确甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞的p21蛋白水平上调是否为转录水平调控。（1）实时定量PCR方法检测甲基莲心碱处理前后U20S细胞内p21mRNA水平,结果提示,不同浓度甲基莲心碱（5,10,20μ M）处理U20S细胞,与对照细胞相比,p21mRNA水平并没有显着的变化；提示甲基莲心碱不是通过转录水平激活p21的表达。（2）为进一步明确甲基莲心碱激活p21的机制,我们用CHX抑制新蛋白质合成,检测甲基莲心碱处理前后p21蛋白质半衰期的变化,结果表明与未处理细胞相比,甲基莲心碱可明显延长p21蛋白半衰期,蛋白降解延迟。初步说明甲基莲心碱从翻译后水平调控p21蛋白的表达水平。●甲基莲心碱诱导p21蛋白的累积对相关信号通路的影响多项研究发现MAPK和AKT信号通路参与调控p21蛋白累积及细胞周期G1期停滞过程。许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的过程中,也伴随着MAPK、AKT等信号通路的激活。为了进一步明确甲基莲心碱诱导p21蛋白累积和细胞周期G1期停滞的分子机制,以及涉及到的信号通路,我们采用western blotting实验检测了ERK、AKT、p38MAPK和JNK1/2四种分子的磷酸化水平,并用抑制激酶活性、RNAi干扰等方法探讨了JNK1/2和p38MAPK在甲基莲心碱诱导p21蛋白累积过程中的作用。1.10μM甲基莲心碱能够显着激活P38MAPK和JNK1/2通路,而对ERK、AKT通路则没有明显影响。实验结果提示P38MAPK、JNK1/2可能参与甲基莲心碱诱导的p21蛋白的累积和细胞周期G1期阻滞,而ERK、AKT不参与调控该过程。2.JNK1/2对甲基莲心碱诱导p21累积的影响：（1）为了明确JNK1/2信号通路是否参与甲基莲心碱诱导p21的累积,采用JNK1/2活性抑制剂SP600125特异性抑制U20S细胞的JNK1/2激酶活性后,检测细胞内p21蛋白的表达水平,结果显示,阻断JNK并没有引起p21蛋白水平的降低,p21蛋白反而明显增加；初步说明JNK并不参与甲基莲心碱诱导p21的累积。（2）为了进一步明确JNK信号通路对甲基莲心碱诱导p21累积的影响,利用siRNA干扰U20S细胞JNK1/2基因表达,发现抑制JNK1/2基因可上调细胞内p21蛋白水平,并且不能抑制甲基莲心碱诱导的p21累积；提示在U20S细胞中JNK信号通路有下调p21蛋白水平的作用。3. p38MAPK信号通路对甲基莲心碱诱导p21累积的影响：（1）为阐明p38MAPK信号通路是否参与甲基莲心碱诱导p21表达的增加,利用p38MAPK活性抑制剂SB203580特异性抑制U20S细胞的p38MAPK激酶活性后,检测p21的表达水平。结果显示：与对照细胞相比,SB203580明显抑制了甲基莲心碱诱导p21蛋白水平的增加。这提示甲基莲心碱引起的p21蛋白累积依赖于p38MAPK信号通路的激活。（2）为进一步验证p38MAPK信号通路在甲基莲心碱引起的p21蛋白累积过程中的作用,利用RNAi技术抑制U20S细胞p38α、β基因表达水平后,检测p21蛋白表达水平。结果表明甲基莲心碱诱导的p21蛋白的累积效应在p38干扰的细胞中明显减弱；BrdU掺入实验证实低表达p38MAPK基因也逆转了甲基莲心碱引起细胞增殖能力的降低。以上实验结果说明甲基莲心碱诱导p21蛋白累积依赖于p38MAPK信号通路的激活。4.明确p38MAPK介导甲基莲心碱诱导p21蛋白累积的分子机制：（1）分析p38MAPK对p21蛋白质半衰期的影响：为研究P38MAPK对甲基莲心碱诱导p21累积的具体机制,采用CHX抑制新蛋白质合成,检测阻断p38MAPK通路后p21蛋白的半衰期。分析实验结果发现,甲基莲心碱明显延长U20S细胞p21蛋白的稳定性,而当用SB203580抑制p38MAPK激酶活性后,SB203580可抑制由甲基莲心碱引起的p21蛋白半衰期的延长。这说明甲基莲心碱诱导的p21蛋白半衰期的延长依赖于P38MAPK信号通路的激活。（2）检测p38MAPK对p-p21Ser130的影响：p38MAPK主要通过磷酸化下游靶分子而发挥作用,为了进一步明确p38MAPK介导p21蛋白稳定性增加的机制,我们选择文献报道的可能与p38MAPK有关的p21蛋白的磷酸化位点进行检测。结果提示甲基莲心碱处理U20S细胞可诱导p21蛋白水平的累积,伴随有p21Ser130位点磷酸化程度升高；当用SB203580抑制p38激酶活性或利用siRNA干扰p38基因表达后,甲基莲心碱不再能够引起细胞内p21蛋白累积,并且p21Ser130位点磷酸化程度降低,实验结果说明激活的p38MAPK信号通路通过磷酸化p21Ser130位点并增加p21蛋白的稳定性,进而介导了甲基莲心碱诱导的细胞周期G1期停滞。本研究的实验结果表明,甲基莲心碱对成骨肉瘤细胞的生长抑制机制是通过诱导p21蛋白的累积而实现的,而p21蛋白的累积并不是发生在转录水平；进一步研究表明,甲基莲心碱激活p38MAPK信号通路,活化的p38MAPK信号通路通过磷酸化p-p21Ser130而延长p21蛋白半衰期,导致p21蛋白在细胞内累积进而引起细胞周期G1期停滞,抑制成骨肉瘤细胞的生长。
李梅,张余[8]（2011）在《细胞凋亡与骨肉瘤》文中研究说明细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,是由基因控制的、不同于细胞坏死的细胞自主有序的死亡。正常生理状态下,机体可通过细胞凋亡清除衰老或异常的细胞,并维持内环境稳态。而在病理状态下,细胞凋亡调控失调会破坏细胞增殖与凋亡之间的平衡,对机体
赵振利,陈兰英,李祺福,石松林,杨海波,荆光军,武福云,孔海燕[9]（2010）在《姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡过程中hnRNP A2/B1表达与定位》文中研究指明姜黄素（curcumin）诱导处理的人成骨肉瘤MG-63细胞,在光镜和电镜观察细胞凋亡的基础上,对hnRNP A2/B1在核基质中存在、分布及其与凋亡相关基因产物在MG-63细胞中的共定位关系进行了研究.经姜黄素处理后,细胞出现染色质凝聚、细胞核固缩、凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征;双向凝胶电泳和质谱鉴定结果显示,hnRNP A2/B1存在于MG-63细胞核基质蛋白组分中,在姜黄素处理后细胞核基质蛋白中表达下调.蛋白质印迹杂交结果,证实hnRNP A2/B1在姜黄素处理前后的MG-63细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.免疫荧光显微镜观察显示,hnRNP A2/B1定位于MG-63细胞核基质纤维上,经姜黄素处理后出现分布位置与表达水平变化.激光扫描共聚焦显微镜的观察结果显示,hnRNP A2/B1在MG-63细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2、Fas和p53等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.研究结果证实了hnRNP A2/B1定位于核基质纤维上,是一种核基质蛋白,在姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63凋亡过程中的表达与分布变化及其与凋亡相关基因的关系显然对MG-63细胞凋亡具有重要影响,这为深入揭示肿瘤细胞凋亡的机制提供了重要科学依据和深入探索的新方向.
刘用金[10]（2009）在《特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡中作用的初步研究》文中研究说明本论文以姜黄素（curcumin,Cur）处理人食管癌EC9706细胞,在鉴定姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡诱导效果的基础上,综合应用亚细胞蛋白质组学分析、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术,对EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的变化进行了较为系统的研究。分析鉴定和确证与EC9706细胞凋亡相关的特异核基质蛋白,并研究特异核基质蛋白与人食管癌EC9706细胞凋亡相关基因在细胞内的共定位关系与变化,探索它们在人食管癌细胞凋亡诱导过程中的调控作用,以期能够在较为整体水平上进一步认识人食管癌细胞癌变与凋亡机理问题,从而找出人食管癌细胞凋亡相关的靶向性蛋白和深入探索的研究方向。实验结果表明,经30μmol/L姜黄素处理之后,EC9706细胞增殖受到明显抑制,细胞生长抑制率达83.88%,细胞发生G0/G1期阻滞。光镜观察结果显示,经姜黄素诱导处理后的EC9706细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚等显着的细胞凋亡特征。琼脂糖凝胶电泳显示EC9706细胞出现凋亡典型的DNA梯状条带。Hoechst染色显示细胞核内出现浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光。免疫细胞化学检测结果显示,经姜黄素处理后,EC9706细胞内的抑凋亡基因bcl-2表达下调,促凋亡基因bax、p53、fas等表达上调。双向凝胶电泳与质谱分析共鉴定12种蛋白,其中在凋亡的EC9706细胞中表达上调的有:Transcription elongation factor A（SII）-like 4（TCEAL4）、CCT8protein、Tara等3种核基质蛋白;表达下调的有:Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin、Translation initiation factor eIF-2B subunit beta等9种核基质蛋白。并进一步通过蛋白免疫印迹确证了Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B、Vimentin等核基质蛋白的变化。激光共聚焦显微镜观察显示特异核基质蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B等与抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系,并且它们的表达水平和细胞定位在细胞凋亡诱导前后均发生了改变。研究结果表明,30μmol/L姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡具有显着诱导作用,并上调促凋亡基因bax、p53、fas的表达和下调抑凋亡基因bcl-2的表达。在EC9706细胞凋亡过程中,其核基质蛋白组成产生了TCEAL4、CCT8 protein、Tara等3种蛋白表达上调和Prohibitin、Spindling-2B、Nucleophosmin等9种蛋白表达下调的明显变化。其中,差异表达核基质蛋白Nucleophosmin、Prohibitin、HSP70、Spindling-2B与EC9706细胞中Bcl-2和Bax蛋白均存在共定位关系,并在细胞凋亡过程中出现移位和分布的改变。由此证实了与人食管癌细胞凋亡相关的特异核基质蛋白的存在和特异核基质蛋白在肿瘤细胞凋亡中的重要作用。研究结果表明姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导与其改变食管癌细胞核基质蛋白的表达,从而调控细胞凋亡相关基因活性,诱导细胞凋亡具有重要的关系。这为在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞凋亡诱导的调控机制以及阐明细胞癌变与凋亡机理提供了科学依据和深入探索研究的新方向,并为食管癌的防治和进一步研究提供新的靶向性蛋白。
二、caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）Scutellarin对骨肉瘤的作用及其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Scutellarin的抗肿瘤作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）过表达Beclin 1诱导的自噬提高了MG63对Gemcitabine的抵抗与Wnt信号通路关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 过表达Beclin 1 基因可诱发MG63骨肉瘤细胞自噬的发生 |
| 1.1 实验目的 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.4.1 MG63骨肉瘤细胞的培养与冻存 |
| 1.4.2 DsRed-LC3-GFP报告系统监测自噬 |
| 1.4.3 Western blot分析 |
| 1.5 实验结果 |
| 第二部分 Beclin 1 过表达后可减少Gemcitabine诱导的凋亡 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 实验仪器及耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验步骤 |
| 2.4.1 MG63骨肉瘤细胞的培养与冻存 |
| 2.4.2 PCR检测Caspase 3、Caspase 7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表达 |
| 2.5 实验结果 |
| 第三部分 Wnt信号通路对自噬的影响 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验试剂 |
| 3.4 实验步骤 |
| 3.4.1 MG63骨肉瘤细胞的培养与冻存 |
| 3.4.2 PCR检测ATG4、Beclin 1、LAMP1、ATG5、ATG12的表达 |
| 3.5 实验结果 |
| 第四部分 Wnt信号通路与骨肉瘤细胞对Gemcitabine抵抗的关系 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 实验仪器 |
| 4.3 实验试剂 |
| 4.4 实验步骤 |
| 4.4.1 MG63骨肉瘤细胞的培养与冻存 |
| 4.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.4.3 应用ELISA技术分析Beclin 1 在MG63细胞上清的水平 |
| 4.5 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）日本鳗鲡Caspase6基因的克隆和表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 Caspase基因在鱼类中的研究进展 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 主要研究内容和技术路线 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物以及菌株 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂及其试剂配制 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 日本鳗鲡组织总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA第一条链的合成及目的基因片段的获取 |
| 2.2.3 SMART-RACE技术获取目的基因全长 |
| 2.2.4 目的基因片段的割胶纯化 |
| 2.2.5 DNA与质粒载体的连接 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 感受态细胞的转化及筛选 |
| 2.2.8 质粒插入片段的检测 |
| 2.2.9 重组质粒测序和质粒提取 |
| 2.2.10 细胞转染重组表达载体的构建 |
| 2.2.11 原核重组表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.12 重组蛋白的表达纯化与复性 |
| 2.2.13 利用纯化蛋白制备多克隆抗体 |
| 2.2.14 酶联免疫分析(间接ELISA法) |
| 2.2.15 HEK-293T细胞的复苏与培养 |
| 2.2.16 AjCasp6基因在细胞中的的定位 |
| 2.2.17 日本鳗鲡肝脏和脾脏细胞的培养 |
| 2.2.18 日本鳗鲡细胞系的冻存与复苏 |
| 2.2.19 日本鳗鲡各组织及肝脏和脾脏细胞中表达 |
| 2.2.20 目的基因的生物信息学分析 |
| 2.2.21 数据获取处理与分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 日本鳗鲡各组织总RNA的提取结果 |
| 3.2 RACE-PCR扩增结果 |
| 3.3 AjCasp6基因序列分析 |
| 3.3.1 AjCasp6的cDNA序列分析 |
| 3.3.2 AjCasp6其他物种Caspase6多重比分析 |
| 3.3.3 AjCasp6其他物种Caspase6系统进化树分析 |
| 3.3.4 日本鳗鲡的AjCasp6的空间结构模拟 |
| 3.4 AjCasp6基因在体内和体外表达分析 |
| 3.4.1 AjCasp6基因在日本鳗鲡各组织中表达分析 |
| 3.4.2 AjCasp6基因在肝脏细胞系中的表达变化 |
| 3.5 原核表达及其检测 |
| 3.5.1 原核重组表达载体的构建结果 |
| 3.5.2 重组载体的原核表达结果及检测 |
| 3.6 AjCasp6蛋白的间接ELISA特异性实验结果 |
| 3.7 日本鳗鲡肝脏细胞系的原代培养和传代培养 |
| 3.7.1 日本鳗鲡肝脏细胞系的原代培养 |
| 3.7.2 日本鳗鲡肝脏细胞系的传代培养 |
| 3.8 不同传代比例对JEL增殖曲线的影响及群体倍增时间分析 |
| 3.9 AjCasp6基因在人类293细胞系中的转染和定位 |
| 3.9.1 AjCasp6基因在人类293细胞系中的转染 |
| 3.9.2 AjCasp6基因在人类293细胞系中的亚细胞定位 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果情况 |
（4）骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展（论文提纲范文）
| 一、骨肉瘤凋亡相关因子研究进展 |
| 1. Bcl-2家族: |
| 2. Fas/Fas L家族: |
| 3. Caspase家族: |
| 4. p53: |
| 5. 其它: |
| 二、骨肉瘤耐药性相关机制 |
| 1. MDR-1基因及其表达产物: |
| 2. MRP: |
| 3. HMGB1: |
| 4. 其它: |
（5）Immunocasp-6融合基因对HER2过表达骨肉瘤的特异、高效性抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 骨肉瘤HER2抗原过度表达检测 |
| 背景 |
| 第一节 骨肉瘤SOSP-9607细胞HER2抗原过度表达检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二节 骨肉瘤SOSP-9607-E10组织HER2抗原过度表达检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 immunocasp-6融合基因的构建 |
| 背景 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 第三章 Immunocasp-6融合基因对骨肉瘤细胞特异、高效性抑制作用体外实验部分 |
| 背景 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Immunocasp-6融合基因对骨肉瘤细胞特异、高效性抑制作用体内实验部分 |
| 背景 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 讨论 |
| 全文小结 |
| 本课题的创新点 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（6）片叶苔素D及其衍生物抗肿瘤机制的研究和鼠李糖受体的发现（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 参考文献 |
| 第2章 Riccardin D诱导成骨肉瘤细胞凋亡作用机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 Riccardin D诱导成骨肉瘤细胞自噬作用机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 Riccardin D衍生物RD-N诱导肿瘤细胞死亡的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 Cathepsin B通过降解BRCA1促进肿瘤DNA损伤 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 实验讨论 |
| 参考文献 |
| 第6章 Solamargine及其衍生物通过RBL受体介导的抗肿瘤作用的初步研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表文章目录 |
| 附录 |
| 附件 |
（7）甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞G1期停滞的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 文献综述：p21的生物学活性及其调控机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）细胞凋亡与骨肉瘤（论文提纲范文）
| 1 与骨肉瘤相关的细胞凋亡途径 |
| 1.1 死亡受体配体途径 |
| 1.2 线粒体途径 |
| 2 与骨肉瘤相关的细胞凋亡因子 |
| 2.1 Bcl-2家族蛋白 |
| 2.2 IAPs家族 |
| 2.3 p53 |
| 2.4 caspases家族 |
| 3 针对细胞凋亡的骨肉瘤治疗 |
| 3.1 放疗 |
| 3.2 化疗 |
| 3.3 热疗 |
| 3.4 基因治疗 |
| 3.5 其它应用 |
| 4 结语 |
（9）姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡过程中hnRNP A2/B1表达与定位（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞培养和凋亡诱导处理 |
| 1.3 Hoechst33258荧光染色检测 |
| 1.4 透射电镜样品制备与观察 |
| 1.5 核基质蛋白的提取 |
| 1.6 双向凝胶电泳与图像分析 |
| 1.7 核基质蛋白的质谱鉴定 |
| 1.8 Western印迹法检测 |
| 1.9 核基质-中间纤维系统观察样品制备 |
| 1.1 0 光镜观察与荧光显微镜观察样品制备 |
| 1.1 1 激光共聚焦显微镜样品的制备与观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hoechst33258染色 |
| 2.2 透射电镜观察 |
| 2.3 双向凝胶电泳与质谱分析 |
| 2.4 免疫印迹法结果分析 |
| 2.5 hnRNP A2/B1在人成骨肉瘤MG-63细胞核基质-中间纤维系统的定位和表达 |
| 2.6 hnRNP A2/B1与凋亡相关基因表达产物在人成骨肉瘤MG-63细胞内的共定位关系 |
| 2.6.1 hnRNP A2/B1和Bax在人成骨肉瘤MG-63细胞内的共定位关系 |
| 2.6.2 hnNRNP A2/B1和Bcl-2在人成骨肉瘤MG-63细胞内的共定位关系 |
| 2.6.3 hnRNP A2/B1和Fas在人成骨肉瘤MG-63细胞内的共定位关系 |
| 2.6.4 hnRNP A2/B1和mtP53在人成骨肉瘤MG-63细胞内的共定位关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 hnRNP A2/B1在核基质上的定位及其在MG-63细胞凋亡过程中的表达变化 |
| 3.2 hnRNP A2/B1与凋亡相关基因产物的共定位关系及其在MG-63细胞凋亡过程中的变化 |
（10）特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡中作用的初步研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| Content |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 肿瘤细胞凋亡诱导及其调控机理研究意义与问题 |
| 2 细胞核基质及其在细胞生命活动中的重要作用 |
| 2.1 核基质 |
| 2.2 核基质蛋白和核基质结合蛋白 |
| 2.3 核基质异常和细胞癌变关系的研究 |
| 2.4 核基质在细胞凋亡中的变化研究 |
| 3 食管癌细胞凋亡研究及其存在问题 |
| 4 姜黄素及其在细胞凋亡研究中的应用 |
| 5 本论文具体研究工作及其科学意义 |
| 材料与方法 |
| 1 试剂与材料 |
| 2 主要仪器 |
| 3 细胞培养与凋亡诱导处理 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 凋亡诱导物与细胞凋亡诱导处理 |
| 4 姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.1 生长曲线的测定 |
| 4.2 细胞周期的测定 |
| 4.3 HE染色细胞形态光镜样品制备 |
| 4.4 Hoechst染色 |
| 4.5 DNA提取与电泳分析 |
| 4.6 人食管EC9706细胞凋亡相关基因表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 4.6.1 人食管癌EC9706细胞抑凋亡基因bcl-2表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 4.6.2 人食管癌EC9706细胞抑凋亡基因bax、p53、fas表达产物的免疫细胞化学检测 |
| 5 姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白的组成变化 |
| 5.1 核基质蛋白的抽提 |
| 5.2 双向凝胶电泳分析 |
| 5.3 MALDI-TOF质谱分析 |
| 5.4蛋白质印迹杂交检测 |
| 6 激光共聚焦显微镜观察样品的制备与观察 |
| 实验结果 |
| 1 姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导效果 |
| 1.1 姜黄素诱导处理前后EC9706细胞生长曲线的测定结果 |
| 1.2 姜黄素诱导处理前后EC9706细胞周期的测定结果 |
| 1.3 姜黄素诱导处理前后EC9706细胞H.E.染色结果 |
| 1.4 姜黄素诱导处理前后EC9706细胞Hochest染色结果 |
| 1.5 姜黄素诱导处理前后EC9706细胞DNA电泳结果 |
| 1.6 姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 1.6.1 姜黄素对人食管癌EC9706细胞Bcl-2蛋白表达的影响 |
| 1.6.2 姜黄素对人食管癌EC9706细胞Bax蛋白表达的影响 |
| 1.6.3 姜黄素对人食管癌EC9706细胞p53蛋白表达的影响 |
| 1.6.4 姜黄素对人食管癌EC9706细胞Fas蛋白表达的影响 |
| 2 姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质蛋白表达的变化 |
| 2.1 双向电泳与凝胶图像分析结果 |
| 2.2 差异表达的核基质蛋白的MALDI-TOF质谱和肽指纹鉴定结果 |
| 2.3 差异表达的核基质蛋白的确证 |
| 3 特异核基质蛋白在姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡过程中的变化 |
| 3.1 PHB与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 3.2 NPM与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 3.3 HSP70与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 3.4 Spindlin-2B与抑凋亡基因bcl-2及促凋亡基因bax表达产物在细胞内的共定位观察结果 |
| 讨论 |
| 1 姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用 |
| 1.1 姜黄素对EC9706细胞的增殖与细胞周期进程的影响 |
| 1.2 姜黄素对EC9706细胞形态的影响 |
| 1.3 姜黄素对EC9706细胞核与DNA的影响 |
| 1.4 姜黄素对EC9706细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 2 姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡过程中核基质组成变化的影响 |
| 2.1 姜黄素对EC9706细胞凋亡过程中核基质组成变化的影响 |
| 2.2 差异表达核基质蛋白的确证 |
| 3 差异核基质蛋白在EC9706细胞凋亡过程中的功能作用 |
| 3.1 LMNA |
| 3.2 Vimentin |
| 3.3 Prohibitin |
| 3.4 Nucleophosmin |
| 3.5 HSP70 |
| 3.6 其它蛋白 |
| 4 特异核基质蛋白在人食管癌EC9706细胞凋亡过程中与凋亡相关基因产物Bcl-2和Bax的关系 |
| 4.1 Bcl-2与特异核基质蛋白的关系 |
| 4.1.1 Prohibitin与Bcl-2的关系 |
| 4.1.2 Nucleophosmin与Bcl-2的关系 |
| 4.1.3 HSP70与Bcl-2的关系 |
| 4.1.4 Spindlin-2B与Bcl-2的关系 |
| 4.2 Bax与特异核基质蛋白的关系 |
| 4.2.1 Prohibitin与Bax的关系 |
| 4.2.2 Nucleophosmin与Bax的关系 |
| 4.2.3 HSP70与Bax的关系 |
| 4.2.4 Spindlin-2B与Bax的关系 |
| 5 特异核基质蛋白在姜黄素诱导EC9706细胞凋亡过程中的调控作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 版图说明 |
| 致谢 |
四、caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]Scutellarin对骨肉瘤的作用及其分子机制[D]. 韩健. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]过表达Beclin 1诱导的自噬提高了MG63对Gemcitabine的抵抗与Wnt信号通路关系的研究[D]. 陶昊. 青岛大学, 2017(12)
- [3]日本鳗鲡Caspase6基因的克隆和表达分析[D]. 张在鹏. 集美大学, 2016(05)
- [4]骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展[J]. 陈楷,吕书军,付东,李国东,蔡郑东. 中国骨与关节杂志, 2015(01)
- [5]Immunocasp-6融合基因对HER2过表达骨肉瘤的特异、高效性抑制作用[D]. 周本根. 南方医科大学, 2014(01)
- [6]片叶苔素D及其衍生物抗肿瘤机制的研究和鼠李糖受体的发现[D]. 王燕燕. 山东大学, 2013(10)
- [7]甲基莲心碱诱导人成骨肉瘤细胞G1期停滞的分子机制研究[D]. 张锡宇. 山东大学, 2012(12)
- [8]细胞凋亡与骨肉瘤[J]. 李梅,张余. 中国骨科临床与基础研究杂志, 2011(04)
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