一、p27~(kip1)在胃癌中的表达及与临床病理分期和预后的关系（论文文献综述）
饶敏[1]（2021）在《hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究》文中指出背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,是全球第三大癌症致死原因。我国胃癌的发病率及死亡率均高于世界平均水平。胃癌病程隐匿,目前早期诊断及治疗的手段仍有局限。circRNA成为近年肿瘤研究的热点,其可作为竞争性内源RNA与miRNA结合,参与相应mRNA的表达调控。circRNA-miRNA-mRNA网络这一全新基因表达调控模式与肿瘤包括胃癌的发生发展关系密切。而外泌体中的circRNA,存在于肿瘤微环境及各种体液中,不仅是肿瘤细胞与其微环境之间信息交流的桥梁,也因其方便检测而被认为是潜在的肿瘤生物标志物。许多研究已经探索了它们在胃癌诊断以及新型治疗中的可能应用。近年来,多项高通量分析关注了胃癌组织和体液中差异表达的circRNA（DE circRNA）,但血浆外泌体目前尚无研究报道。因此,本研究希望通过高通量RNA测序检测出胃癌患者血浆外泌体中的DE circRNA,进而通过体内外功能实验筛选出在胃癌进展中发挥重要功能的circRNA,从而帮助阐明胃癌的发病机制,并为胃癌的诊断和治疗提供新的线索。研究方法:（1）使用exoEasy Maxi Kit（Qiagen）从胃癌（GC）患者及健康对照（HC）血浆中分离外泌体,通过Western blot和透射电子显微镜对外泌体性状进行鉴定;而后通过高通量RNA测序和生物信息学分析,筛选外泌体中差异表达的circRNA;并通过GO和KEGG分析预测DE circRNA可能的发挥的功能和参与的信号通路;通过RT-q PCR对高通量测序结果加以验证,并筛选出进行功能研究的circRNA。（2）通过统计学分析评估GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。（3）利用circBase数据库查询（http://www.circbase.org）hsa＿circ＿0014606的序列、亲本基因及染色体定位。使用NCBI的基因组工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）进行基因组序列比对。利用Circ Bank数据库（http://www.circbank.cn/）查询hsa＿circ＿0014606的翻译和修饰信息。（4）构建过表达和敲减hsa＿circ＿0014606的慢病毒载体,包装慢病毒,感染GC细胞建立稳定细胞株。通过CCK8实验检测GC细胞增殖;通过Annexin VAlexa Fluor 488/PI染色检测细胞凋亡;通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力;通过基质胶包被的Transwell实验检测细胞侵袭能力。（5）使用PMA刺激THP-1细胞使其分化为M0巨噬细胞,与GC细胞外泌体共培养后通过RT-q PCR检测M1巨噬细胞的标志性分子IL-12和i Nos,以及M2巨噬细胞的标志性分子IL-10和Arg-1,从而确定巨噬细胞的极化方向。（6）通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0014606的靶标miRNA及其下游靶基因;双荧光素酶报告实验验证它们之间的结合和相互作用。（7）使用NCD免疫缺陷小鼠构建了GC移植瘤模型以确定hsa＿circ＿0014606在体内对GC细胞成瘤的影响,及其对靶标miRNA及其下游靶基因的影响。研究结果:（1）我们采集了5名GC患者和5名健康供者的外周血样本,并从血浆中成功分离出外泌体。通过高通量RNA测序,在所有血浆外泌体样品中共检测到67,880个circRNA,筛选出1,060个在GC中差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。（2）GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。（3）RT-q PCR结果显示选定的6个上调的circRNA在GC细胞和/或GC组织中显着上调;其中hsa＿circ＿0014606上调最为稳定及显着。（4）GC患者血浆外泌体中hsa＿circ＿0014606的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。（5）hsa＿circ＿0014606来自YY1AP1（YY1 associated protein 1）基因,为外显子-内含子circRNA（EIciRNA）。其可能具有编码蛋白质的能力。（6）体外实验证实过表达hsa＿circ＿0014606促进GC细胞增殖、迁移和侵袭;敲减hsa＿circ＿0014606促进GC细胞凋亡。（7）AGS细胞外泌体能够促进THP-1细胞向M2巨噬细胞方向极化;过表达hsa＿circ＿0014606后的AGS细胞外泌体进一步促进了M2极化,而敲减hsa＿circ＿0014606则抑制了M2极化。（8）miRNA-194-5p是hsa＿circ＿0014606的靶miRNA,其在GC组织中表达下调,在AGS细胞中过表达hsa＿circ＿0014606可显着抑制其表达。（9）双荧光素酶报告实验证实hsa＿circ＿0014606可与miRNA-194-5P结合。（10）YAP1被预测为miRNA-194-5p的靶基因,双荧光素酶报告实验证实YAP1可与miRNA-194-5p结合,后者能够促进其转录本降解。（11）hsa＿circ＿0014606促进AGS细胞NCD小鼠体内成瘤,且可下调miRNA-194-5p并上调YAP1的表达。结论:通过高通量RNA测序,我们在GC患者血浆外泌体样品中筛选出1,060个差异表达的circRNA,其中620个上调,440个下调。GO和KEGG分析预测这些DE circRNA可能参与了与GC发生发展密切相关的生物过程和通路,如细胞周期、细胞骨架组织、细胞对DNA损伤的反应和GTPase活性的调节以及磷脂酰肌醇、MAPK、甲状腺激素、趋化因子和Wnt信号通路。RT-q PCR证实了高通量测序的结果,且提示血浆外泌体中表达上调的circRNA很可能来自肿瘤组织和细胞。hsa＿circ＿0014606在GC组织和细胞中上调最为显着,其在患者血浆外泌体中的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关。功能研究表明hsa＿circ＿0014606可能作为miRNA-194-5p的海绵,上调YAP1的表达,在GC细胞内发挥促进增殖、迁移、侵袭并抑制凋亡的功能,并可进入GC细胞外泌体促进共培养的巨噬细胞向M2表型极化,从而促进GC的发生发展。
吕星儿[2]（2021）在《胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究》文中研究说明目的:胃癌,是全球癌症发病率第五,癌症相关死亡原因第三的癌种。它在我国的发病率为第二位、死亡率为第三位。无论是在全球还是我国范围内,胃癌都是严重威胁人类健康的癌症之一。尽管随着标准术式推广,手术技法日渐纯熟,其它辅助治疗手段的提高,并且在分子机制、治疗选择和理解等方面都取得了重要进展,胃癌治疗水平有所提高,胃癌的预后仍不满意。因此,探寻胃癌发生发展中复杂的分子机制,为胃癌患者发现高效的胃癌诊断、预后评价的分子标志物和寻找靶向治疗的位点具有重要的临床意义。本研究旨在从公共数据库中寻找胃癌预后预测基因,并验证其表达与功能,对未来临床上选择合适的胃癌预后预测基因,建立胃癌预后预测模型,以及个体化精准治疗提供循证医学依据。研究方法:第一部分,我们通过GEO、TCGA数据库以及本地测序数据,进行胃癌基因差异表达以及预后预测分析。根据测序及芯片数据结果,选择ZNF326为我们的主要研究对象,并在TCGA数据库中对其肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、干细胞指数等进行相关分析。通过免疫组织化学染色的方法,分析ZNF326在胃癌组织中的表达水平,并且对其与患者病理资料及预后信息进行相关性分析,验证并探寻其用于临床诊断的价值与意义。第二部分,通过CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验和划痕实验测定ZNF326对胃癌细胞生物学特性的改变。通过裸鼠皮下成瘤和肺转移模型实验,验证ZNF326对胃癌细胞体内功能的影响。通过western blotting实验研究ZNF326对胃癌细胞EMT表型的影响。结果:1、在公共数据库中,ZNF326无论是在m RNA表达水平还是蛋白表达水平均与胃癌患者预后呈显着负相关,p值均小于0.001,即癌中相对表达较高者预后更好,且为独立于TNM分期的预后影响因子;2、在TCGA数据集中,ZNF326表达与TMB呈正相关（p<0.001,R=0.17）,与MSI呈正相关（p<0.001,R=0.28）,与基于表达数据所计算出的干细胞指数呈正相关（p<0.001,R=0.23）;3、ZNF326在胃癌组织中显着低表达（P=0.008）;4、ZNF326是独立的胃癌预后影响因素;5、在体外以及体内功能实验中,过表达ZNF326均能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,而敲除则促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;6、ZNF326能够影响胃癌细胞EMT表型,过表达ZNF326能抑制胃癌细胞向间充质型转化,反之敲除ZNF326则能够导致胃癌细胞上皮型性状的丢失。结论:1、ZNF326在公开数据库中是一个独立的胃癌预后影响因子;2、ZNF326在胃癌组织中显着低表达,且是独立预后影响因素;3、ZNF326在体内外实验中均抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;4.ZNF326与EMT表型相关。
蒋易[3]（2020）在《ZYX促进胃癌侵袭转移作用机制及在胶质瘤细胞侵袭中的作用》文中进行了进一步梳理胃癌（Gastric cancer,GC）在全球范围内是肿瘤相关死亡的主要原因,排在所有肿瘤的第5位。尽管治疗策略在不断改进和提高,胃癌患者的预后仍不尽人意。侵袭和转移是胃癌的重要生物学特征,也是导致患者预后不良的主要原因。因此,深入探究胃癌侵袭转移的分子机制对于发现胃癌治疗新的靶点并发展胃癌治疗新策略具有十分重要的意义。黏附斑在细胞骨架蛋白和细胞外基质之间的连接以及细胞外信号向细胞内的传导等方面发挥重要作用。斑联蛋白（Zyxin,ZYX）是黏附斑的主要组成成分,其含有LIM结构域,能充当多种蛋白分子的脚手架介导多种蛋白间的相互作用而调控细胞的黏附、增殖和迁移。ZYX还可穿梭于细胞核和细胞质,与相关转录因子相互作用从而在调控转录中发挥作用。近年来,ZYX在肿瘤中的作用受到关注,已报道其在黑色素瘤,肝癌,口腔鳞癌,尤文氏肉瘤和前列腺癌等肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移中发挥重要作用。但ZYX在胃癌的作用尚无报道。本研究检测了胃癌组织中ZYX的表达,并分析了其表达水平与临床病理参数及临床预后的关系;研究了ZYX促进胃癌细胞侵袭转移的作用,并用一系列体内外实验探讨了其可能的分子机制。此外我们还初步探讨了ZYX在胶质瘤迁移、侵袭中的作用。本研究的主要方法、结果和结论如下:1.ZYX在胃癌组织的表达及其临床病理学意义（1）ZYX在胃癌组织中高表达以免疫组化染色（immunohistochemistry stain,IHC）方法对含有208例胃癌组织的组织芯片和17例癌旁组织进行了ZYX表达检测,结果显示ZYX在胃癌组织中的表达显着高于癌旁组织（p<0.0001）。为验证IHC结果,实时定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印迹法（WB）检测6对新鲜胃癌组织及癌旁组织中ZYX的表达,结果表明无论在mRNA水平还是在蛋白水平上,胃癌组织中ZYX的表达都显着高于癌旁组织。TCGA数据库数据的分析结果（p<0.05）也佐证了我们的实验结果。（2）ZYX在胃癌组织中的表达水平与临床病理参数呈正相关而与患者预后呈负相关用SPSS20.0对208例胃癌组织的IHC得分绘制ROC曲线,得到Cutoff值为7.0。根据Cutoff值将胃癌患者分为ZYX高表达组和低表达组。然后分析了ZYX的表达和胃癌患者临床病理参数的相关性,结果表明ZYX的表达水平与肿瘤大小（p=0.015）、T分期（p=0.002）、N分期（p=0.001）和TNM分级（p=0.026）显着相关。Kaplan–Meier生存分析结果显示高表达ZYX的胃癌患者具有更短的总生存期（overall survival,OS）（p<0.0001）和无进展生存期（progression free survival,PFS）（p<0.0001）,KMPLOT的数据分析佐证了我们的实验结果。单因素方差分析和多因素方差分析表明ZYX可以作为胃癌的一个独立预后指标。2.ZYX促进胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力（1）ZYX过表达的XN0422细胞和ZYX敲低的MGC803细胞的构建首先用qRT-PCR及WB筛查了ZYX在胃黏膜上皮细胞（GES-1）和几个本研究所常用胃癌细胞系BGC823、,MGC803、SGC7901及XN0422（本室保存的原代胃癌细胞系）中的表达,结果表明各胃癌细胞系中ZYX的表达均显着高于正常胃黏膜上皮细胞。在胃癌细胞系中,MGC803的ZYX表达水平最高,而XN0422的表达水平较低,因此被分别用慢病毒方法构建成ZYX敲低和ZYX过表达模型,并经qRT-PCR和WB验证其效率后用于后续实验。（2）ZYX促进胃癌细胞体外迁移和侵袭能力划痕实验结果显示,相较于对照细胞,过表达ZYX显着增强XN0422的迁移能力（p=0.0001）,敲低ZYX则显着降低MGC803的迁移能力（p<0.0001）。与迁移实验结果相一致,Metrigel-transwell侵袭实验也表明,相较于对照细胞,过表达ZYX显着增强XN0422的侵袭能力（p<0.0001）,而敲低ZYX显着降低MGC803的侵袭能力（p<0.0001）。（3）ZYX促进胃癌细胞体内转移能力小鼠腹腔转移模型显示,过表达ZYX的XN0422细胞所形成的腹腔转移灶显着多于对照细胞（p=0.0003）,而敲低ZYX的MGC803细胞所形成的腹腔转移灶显着少于对照细胞（p<0.0001）。3.ZYX激活WNK1/Snail通路诱导胃癌细胞EMT的发生（1）磷酸激酶抗体芯片筛选ZYX的下游磷酸激酶以磷酸激酶抗体芯片分析ZYX的下游磷酸激酶,发现过表达ZYX引起XN0422细胞中8种磷酸激酶磷酸化水平上调,其中上调最显着的是WNK1,提示WNK1可能是受ZYX调控的主要下游磷酸激酶分子。这一结果在过表达ZYX的XN0422细胞和敲低ZYX的MGC803细胞中得到WB实验验证。（2）敲低WNK1和WNK1抑制剂显着抑制ZYX的促进胃癌细胞侵袭作用在过表达ZYX的XN0422细胞中使用小干扰RNA（siRNA）敲低WNK1或使用WNK1抑制剂（WNK463）处理后,与对照组相比较其体外侵袭能力显着降低。（3）ZYX激活WNK1/Snail信号通路诱导胃癌EMT的发生过表达ZYX引起XN0422细胞中Snail和N-Cadherin的上调表达以及E-Cadherin的下调表达,而敲低ZYX导致MGC803细胞中Snail和N-Cadherin的下调表达以及E-Cadherin的上调表达。文献报道WNK1能调控Snail的表达。这些结果提示,ZYX可能通过激活WNK1/Snail信号通路诱导胃癌细胞发生EMT,从而促进胃癌细胞的迁移,侵袭和转移。4.ZYX在促进胶质瘤细胞体外迁移、侵袭的作用初探此外,初步实验表明,ZYX具有促进胶质瘤细胞体外迁移、侵袭的作用,为进一步深入研究ZYX在胶质瘤中的作用奠定了基础。结论:1.胃癌组织高表达ZYX,其表达水平与肿瘤大小、T分期、N分期、TNM分期显着正相关,而与胃癌患者总生存期和无进展生存期呈负相关,是胃癌患者的一个独立预后因子;2.ZYX促进胃癌细胞的迁移、侵袭和转移能力;3.ZYX通过激活WNK1/Snail信号通路诱导EMT而促进胃癌细胞的迁移,侵袭和转移。
高梓茗[4]（2020）在《“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制》文中提出目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第四大最常见的恶性肿瘤,是导致癌症相关死亡的第二大原因。据统计,2018年超100万例新增胃癌病例,死亡78.3万人。手术联合放化疗仍是胃癌的首选治疗手段,D2淋巴结清扫加胃切除已成为标准治疗方法。且近年来,胃镜检查的普及有效地提高了胃癌的早期诊断率和长期生存率,但胃癌预后仍不理想,尤其是腹膜转移患者,其积极治疗后的中位总生存期仅为15.6个月。此外,在临床中,尽管无远处转移（M0期）的胃癌患者预后较好,但即使在相同的TNM期患者,生存异质性也较大。且由于消化道肿瘤的高侵袭性,大多数患者在晚期才被诊断出来,失去了治愈性切除的机会。因此,我们迫切需要更好地了解胃癌发生发展的机制,探寻有效的治疗靶点。方法:1.首先从GEO数据库中选取GSE79973芯片,探究其中胃癌差异基因表达。GSE79973共包括了10对胃癌组织和邻近非肿瘤粘膜组织的表达数据。采用DAVID进行GO/KEGG聚类分析,以筛选差异基因富集的通路;并通过STRING进行蛋白互作分析,构建重要的基因表达簇。此外,通过GEPIA数据库验证GSE79973芯片中部分差异基因表达情况,并采用Kaplan-Meier plotter探究该部分基因对胃癌预后的影响。2.收集于中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科行手术切除患者的胃癌组织行免疫组化分析,共48例。体外细胞功能实验（如Transwell、CCK-8及Edu等）探究LAMC1对胃癌细胞HGC27及MGC803细胞的增殖、侵袭转移能力的影响。Western blot实验探究LAMC1下游相关通路蛋白表达情况。裸鼠成瘤实验探究LAMC1对于胃癌细胞体内增殖、成瘤能力的影响。3.瞬转miR-195-5p模拟物（mimic）,检测下游LAMC1蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验证实miR-195-5p可靶向结合LAMC1 mRNA的3’UTR。Real-time PCR证实,KLF4对miR-195-5p及LAMC1 mRNA的表达调控作用。在Rescue恢复实验中,过表达KLF4后抑制mi R-195-5p,并检测LAMC1表达水平。最终采用ChIP及双荧光素酶法明确KLF4与miR-195-5p启动子区域的结合位点。结果:1.在GSE79973中共1598个基因被证实为差异表达基因（|log FC|>1,p<0.01）,其中1298个表达上调基因,其余的330个为表达下调基因;通过GO/KEGG分析发现,1598个差异基因中与细胞黏附相关的基因共126个;2.经STING分析后,ITGA2、LAMC1、THBS2、NID2、FN1为重要的细胞粘附基因簇,且5种基因在胃癌中均为高表达,且ITGA2（HR=1.35,log rank p=0.037）、LAMC1（HR=1.38,log rank p=0.018）及THBS2（HR=0.77,log rank p=0.014）与患者预后密切相关;3.免疫组化及组织Western blotting实验均提示LAMC1在胃癌组织中呈高表达,并与患者的淋巴结转移状态（p=0.003）、TNM分期（p=0.006）密切相关;Kaplan Meier生存分析提示,LAMC1高表达患者的预后较差（Log rank p=0.036）;4.敲低LAMC1后,CCK-8及Edu提示胃癌细胞增殖能力明显下降;而Transwell提示胃癌的侵袭转移能力显着降低。通过裸鼠成瘤实验,我们证实LAMC1敲低可有效降低胃癌细胞成瘤能力;5.抑制LAMC1蛋白表达后,EMT（N-Cadherin、E-Cadherin）、ERK1/2通路（ERK1/2、p-ERK1/2）及细胞干性指标（Nanog、Sox2）的相关蛋白表达均显着改变;6.通过Western blotting及双荧光素酶法证实,miR-195-5p可靶向结合3’UTR区域并抑制LAMC1蛋白表达。7.Real-time PCR证实,KLF4可促进mi R-195-5p转录,并抑制LAMC1mRNA表达水平。8.Rescue恢复实验证实胃癌中存在“KLF4/miR-195-5p/LAMC1”调控轴;而ChIP及双荧光素酶法均证实KLF4可与miR-195-5p启动子区域靶向结合,并促进后者表达,其中结合位点碱基序列为GCCCACACCCAG。结论:1.ITGA2、LAMC1、THBS2、NID2、FN1在胃癌中是重要的差异基因,并可与胃癌的粘附、侵袭转移密切相关。其中ITGA2、LAMC1及THBS2可能会影响胃癌患者预后;2.组织蛋白表达验证LAMC1在胃癌中呈高表达,且与患者的淋巴结转移、TNM分期及预后情况相关;3.细胞实验提示LAMC1可促进胃癌的增殖、侵袭转移能力,并影响EMT、ERK1/2及干细胞相关通路蛋白表达;4.miR-195-5p可靶向结合LAMC1 mRNA的3’UTR,并抑制后者表达;KLF4在胃癌中作为转录因子,可靶向结合miR-195-5p启动子并促进后者转录,从而间接调控LAMC1蛋白表达。因此,在胃癌中存在“KLF4/miR-195-5p/LAMC1”调控轴,并起到重要的抑癌作用。
张冬冬[5]（2020）在《转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究》文中研究指明肿瘤的发生发展是一种多因素,多步骤的疾病,这其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活等多种机制的失调。胃癌是消化系统中一种常见的恶性肿瘤,2018年在全球造成超过100W的新发病例和约78W的死亡病例的出现,这使得它成为全球范围内第五大最常被诊断出的癌症以及癌症死亡的第三大主要原因。尽管我们在外科手术治疗及辅助放化疗方面取得了长足的发展,预后不良仍旧是胃癌的顽疾之一。活跃的增殖性、强烈的侵袭及转移性以及胃癌本身的高异质性都是造成胃癌难以治愈的重要因素。因此研究探索介导胃癌发生发展的分子机制以及细胞调节机制显得尤为重要。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种关键方式,它在真核细胞生物体内的诸多生物学过程中起着至关重要的调节作用,它可以参与调节细胞周期、基因转录、细胞增殖以及信号转导等多种生理过程。此外,泛素化的调控机制在肿瘤的发生发展中也起着至关重要的作用,多种癌基因亦或是抑癌基因的表达受到这种机制的监管。蛋白质泛素化降解的基本方式:泛素亦或是泛素样蛋白通过结合泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和决定底物特异性的泛素连接酶E3形成复合物,然后附着于特异性的底物,从而实现对底物的泛素化标记,然后再通过泛素蛋白酶体系统对底物完成最终的降解。NUB1（negative regulator of ubiquitin-like protein-1）是泛素化调控系统的负性调节因子,它的主要调节目标是一种高度保守的泛素样蛋白NEDD8,NUB1可以通过负性调节NEDD8与其靶蛋白的缀合系统来控制多种底物的泛素化降解。目前,已有许多研究证实,NUB1在诸多类型的癌症中均有异常的表达,例如肾癌、直肠癌和宫颈癌。但是它在胃癌中的表达情况以及调控机制,我们却知之甚少。转移是造成癌症相关死亡的主要原因,上皮-间质转化（EMT）程序的部分激活被认为是增加肿瘤启动和转移潜能的关键驱动器。包括胃癌在内,几乎所有肿瘤的恶性进展均与EMT密切相关。上皮细胞形态过渡到间充质细胞形态时,多种EMT相关标记物会随之发生改变,如上皮细胞形态标记物E-钙黏蛋白表达会下降,同时间充质细胞形态的相关标记物,特别是N-钙黏蛋白,波形蛋白以及基质金属蛋白酶的表达会升高。这些改变会进一步促进肿瘤的恶性进展。此外,多个信号通路的激活也会诱导EMT,包括经典WNT,TGF-β,NF-κB通路等等。泛素化机制可以参与调控这些通路中部分关键蛋白的表达。然而NUB1作为负性调控泛素化过程的关键转录因子,它对于胃癌的侵袭和EMT的调控作用,我们仍然是未知的。本研究中,基于116例术后胃癌患者的组织切片以及对应的癌旁组织切片的免疫组织化学染色结果,我们对比了NUB1蛋白在癌组织与癌旁组织中的表达情况,同时分析了NUB1蛋白表达与临床病理特征之间的关系。此外,结合网络在线数据库,包括蛋白质表达和mRNA表达两个层面在内,我们还分析了NUB1表达与患者预后的关系。另一方面,我们还通过体外的细胞实验,验证了过表达NUB1对于胃癌的恶性生物学行为的影响作用,包括增殖、迁移和侵袭。通过流式细胞术分析了它对细胞周期的调控作用,尤其是控制细胞周期G1/S期的过渡。利用实时定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹实验分析了NUB1对于EMT部分关键指标和抑癌基因p27Kip1表达的调控作用。本次研究,我们重点讨论了NUB1的过表达如何调控胃癌的发生和进展以及对于胃癌上皮间质转化（EMT）的影响,这些新的发现可为NUB1在抗癌过程中充当新型药物的载体或是诊断标记物提供帮助。当然,根据组化实验的结果,NUB1蛋白的表达对于胃癌的临床意义也是重要新发现的一部分。鉴于NUB1在胃癌的发生发展上积极的抑癌作用,我们希望通过此项研究帮助科研工作者更好的认识胃癌的发病机制,也为临床上制定更加精准的抗肿瘤方案提供潜在的策略。第一部分NUB1蛋白在胃癌及癌旁样本中的表达情况的研究目的:探索胃癌及癌旁病理组织样本中NUB1蛋白表达的意义。材料和方法:利用免疫组化染色的方法,对116例胃癌及配对的癌旁样本的石蜡切片进行检测,分析了NUB1在癌与癌旁样本中的表达差异。基于患者病理样本的组化评分结果,通过卡方检验和斯皮尔曼相关性系数分析了NUB1表达与临床病理特征之间的关系。同时,结合在线数据库mRNA表达数据,采用Kaplan-Meier估计和Log-Rank检验的方法,我们在蛋白质水平和mRNA水平两个层面上分析了NUB1表达与患者预后的关系,同时,通过构建COX比例风险模型,基于单因素和多因素的分析模式,评价了NUB1表达对于胃癌患者预后的价值。最后,结合患者淋巴结检查的临床信息,分析了NUB1表达与患者淋巴结阳性率之间的关系。结果:免疫组化实验结果显示,相对于癌旁样本,NUB1在胃癌组织中表达下调。NUB1蛋白表达水平与患者肿瘤大小、Borrmann分型、淋巴结转移、淋巴管浸润、TNM分期以及患者生存状态密切相关。生存分析结果显示,无论在蛋白质表达水平,还是在mRNA表达水平,低表达NUB1的患者预后更差。同时结合COX多因素分析的结果,包括Borrmann分型和TNM分期在内,证实NUB1的表达与胃癌患者的预后显着相关,结果有统计学意义。此外,淋巴结阳性率的比较证实,低表达NUB1的患者相对于高表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结阳性率。结论:NUB1在胃癌组织中的低表达以及它与临床病理特征之间的紧密联系提示NUB1对于胃癌的发生发展意义重大。生存分析结果提示NUB1表达与患者预后之间存在密切关联,同时预后的多因素分析结果证实NUB1的表达有成为胃癌患者独立预后因素的可能。最后,淋巴结阳性率的比较提示低表达NUB1的患者拥有更高的淋巴结转移的风险。第二部分细胞实验研究NUB1调控胃癌恶性表型的作用机制目的:探索体外NUB1对于胃癌恶性生物学行为的调控作用。材料和方法:NUB1过表达细胞模型通过慢病毒转染的方式进行构建,实时定量PCR（RT-PCR）和蛋白质印迹实验确定慢病毒的转染效率。利用CCK-8试剂盒检测NUB1对于胃癌细胞系增殖活性的影响。利用荧光激活细胞分选术（FACS）分析其对细胞周期的影响作用。体外细胞划痕实验和基质胶Transwell实验验证NUB1对癌细胞迁移和侵袭的影响,最后通过蛋白质印迹实验检测NUB1对于EMT相关指标蛋白和调控细胞周期的关键抑癌基因p27Kip1的调节作用。结果:体外细胞实验证实,过表达NUB1可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。流式细胞术证实了过表达NUB1阻滞了细胞周期G1/S期的转变过渡。NUB1过表达增加了抑癌基因p27Kip1的蛋白表达水平。然而,实时定量RCR实验结果却显示,NUB1过表达并没上调p27Kip1的mRNA表达水平,对照组与试验组之间的差异无统计学意义。此外,蛋白质印迹实验表明,NUB1过表达上调了E-钙黏蛋白的表达,同时下调了N-钙黏蛋白、波形蛋白和基质金属蛋白酶2（MMP2）的表达。结论:过表达NUB1抑制了胃癌细胞在体外的增殖活性,并造成了细胞周期G1/S期的阻滞。同时,过表达NUB1上调了抑癌基因p27Kip1蛋白的表达,但是其mRNA表达没有显着变化。此外,过表达NUB1能够通过调控EMT相关蛋白的表达抑制胃癌细胞的迁移及侵袭的能力。
刘磊[6]（2019）在《Norrin对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及可能机制》文中研究表明肿瘤是目前导致人类死亡的第二大病因,仅排在心血管疾病之后,是严重危害人类健康的重大疾病。肿瘤的形式多种多样,可发生于机体任何组织器官,而消化系统是肿瘤的高发部位,在前十大恶性肿瘤中,消化系统肿瘤就占5种。胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,在肿瘤中的全球发病率排第五位,死亡率则排第三位,我国的发病率和死亡率均排第2位,严重危害人类健康。胃癌一直都是肿瘤领域研究的重点和热点,其发生发展机制复杂,许多分子和信号通路均参与了胃癌的发生发展。但到目前为止,我们对胃癌发生的确切机制了解仍相对不足,胃癌的临床治疗效果特别是进展期胃癌仍较差,总体5年生存率不超过25%。因此,加强对胃癌发生发展分子机制的研究对于胃癌的临床诊治具有重大意义。信号转导通路包括经典的Wnt/β-catenin、AKT等,在胃癌的发生发展中发挥着重要作用,参与调控胃癌细胞恶性增殖、侵袭转移、化疗抵抗以及肿瘤微环境等诸多方面,因而研究信号转导通路对于丰富胃癌发生发展的分子机制有重大的理论意义和临床价值。Norrin是可以激活经典的Wnt/β-catenin信号通路的非经典配体,先天性x连锁智力迟钝盲聋病,亦称Norrie病（Norrie disease）,由其致病基因NDP（Norrie disease pseudoglioma gene）编码。Norrin作为一种以旁分泌或自分泌起作用的分泌型蛋白,其C端富含半胱氨酸,故属于TGF-β家族成员,但其特殊性是可以通过与Frizzled-4、Lrp5及Lrp6结合进而激活Wnt/β-catenin信号通路,参与调控机体众多生物学功能,对于维持视网膜、内耳以及脑的正常功能都发挥着重要作用。近年来,发现Norrin在肿瘤的发生发展也起着重要作用。有文献报道,在结肠癌细胞株以及结肠癌组织中发现了Norrin及其下游结合分子Frizzled-4、Lrp5等的表达,其可能通过促进血管生成进而参与结肠癌的发生发展;另外有文献报道,Norrin可能在卵巢癌中起抑制作用,并与卵巢癌患者预后相关。目前国内外的研究结果显示Norrin在肿瘤中可能存在促癌与抑癌的双重作用,提示Norrin在肿瘤的作用可能具有组织特异性。目前关于Norrin与胃癌的研究极少,Norrin在胃癌组织中是否能激活经典的Wnt/β-catenin信号通路尚不明确,在胃癌组织中Norrin与其他信号通路的关系则更不清楚。因此,明确Norrin是否影响信号转导通路,以及Norrin在胃癌发生发展进程中是否具有一定作用,对于进一步阐明胃癌发生发展的分子机制和提高胃癌临床诊治效果具有一定的理论意义和临床价值。研究方法与研究结果1)Western blot检测Norrin在正常胃黏膜上皮细胞GES-1和不同分化程度的人胃腺癌细胞株SGC7901、AGS、MGC823和XN0422中的表达情况,发现Norrin在各种分化程度的人胃腺癌细胞株中含量均明显高于正常胃黏膜上皮细胞GES-1。2)通过免疫组织化学染色,统计分析临床病理资料,我们发现Norrin在胃癌组织中表达高于癌旁组织;Norrin蛋白的表达高低与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、病理学分级无统计学差异,（P>0.05）;而Norrin蛋白的表达高低与胃癌患者的T分期、N分期、TNM分期和术后生存率有统计学差异,（P<0.05）。另外,分析TCGA和KM-Plotter公共数据库,发现Norrin mRNA的表达高低与胃癌患者的术后生存率具有统计学差异,（P<0.05）。进一步分析KM-Plotter公共数据库,发现胃癌患者Norrin mRNA表达水平与earlier first progression（FP）和post progression survival（PPS）有统计学差异,（P<0.05）。3)采用慢病毒转染的方法成功构建Norrin低表达人胃癌细胞株XN0422（Sh-Norrin组）,和转染了空载病毒、Norrin正常表达的XN0422细胞株（Sh-Ctrl组）。4)采用Western blot检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的Frizzled-4、Lrp5以及Lrp6的含量,结果显示Norrin并不影响其下游结合分子Frizzled-4、Lrp5及Lrp6的表达水平。5)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的β-catenin、磷酸化的β-catenin及部分Wnt/β-catenin下游靶基因CD44、MMP7,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组β-catenin表达水平不变、磷酸化的β-catenin增多、CD44和MMP7减少。分析TCGA数据库,显示较多Wnt/β-catenin下游靶基因如Lgr5、CDX1、ASCL2以及SOX9的表达水平与Norrin无明显相关性。6)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的AKT、Hippo、JNK、P38和ERK1/2信号通路活性,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组p-AKT明显降低,总AKT不变;Hippo、JNK、P38和ERK1/2活性无明显改变。7)采用Western blot,检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的m-TOR、磷酸化的m-TOR、Bim以及P27kip1的表达水平,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组m-TOR不变、p-m-TOR减少、Bim以及P27kip1增加。分析TCGA数据库显示,P27kip1的表达水平与Norrin呈负相关（P<0.05）;而Rictor的表达水平与Norrin呈正相关（P<0.01）。8)加入小分子AKT激活剂SC79恢复AKT活性,采取CCK8、平板克隆及流式细胞学检测细胞周期等方法检测XN0422细胞增殖能力,我们发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组CCK8 OD值降低、平板克隆数减少、S期细胞减少而G0/G1细胞增多（P<0.05）;而恢复AKT活性后,Sh-Norrin-SC79组较Sh-Norrin-DMSO组CCK8 OD值升高、平板克隆数增加、S期细胞增多而G0/G1细胞减少,（P<0.05）。9)加入小分子AKT激活剂SC79恢复AKT活性,采用划痕实验和Transwell实验,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组迁移的距离减短、Migration和Invation的细胞数目减少,（P<0.05）;而恢复AKT活性后,Sh-Norrin-SC79组较Sh-Norrin-DMSO组迁移的距离增加、Migration和Invation的细胞数目增多,（P<0.05）。10)Western blot检测Sh-Ctrl组和Sh-Norrin组XN0422细胞的EMT标志物变化,发现Sh-Norrin组较Sh-Ctrl组E-cadherin及Slug无明显变化,N-cadherin、Vimentin、Claudin-1、Snail、Zeb1均降低。结论1)Norrin蛋白在人胃癌细胞株SGC7901、AGS、MGC823和XN0422中表达含量均高于正常胃黏膜上皮细胞GES-1。免疫组化结果表明胃癌组织和癌旁组织中Norrin的表达含量有显着差异,结合临床病理资料分析表明,Norrin与胃癌患者的T分期、N分期、TNM分期以及预后密切相关。数据库结果显示Norrin的表达含量与胃癌患者预后相关。这提示Norrin很可能是促癌分子,在胃癌的发生发展过程起到一定的促进作用。2)在人胃癌细胞株XN0422中敲低Norrin可导致AKT信号通路活性明显下降,而β-catenin表达不变、P-β-catenin表达增加、部分Wnt/β-catenin下游靶基因CD44、MMP7表达降低,说明不能完全排除Norrin对Wnt/β-catenin的作用,Norrin可能部分通过AKT信号通路发挥其生物学功能。3)干扰Norrin的表达后,XN0422细胞的增殖及侵袭迁移能力降低,而加入Norrin小分子AKT激活剂SC79可在一定层度上恢复增殖及侵袭迁移能力,说明Norrin可部分通过AKT信号通路调控胃癌细胞的增殖及侵袭迁移,从而参与胃癌的发生发展。
刘辉[7]（2019）在《川楝素介导circYAP1调控胃癌生长的分子机制研究》文中认为研究背景与目的:胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,早期发病隐匿,进展期胃癌预后差。研究发现环状RNA在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用,我们前期研究发现circYAP1在胃癌组织中低表达,中药有效成分川楝素具有有效的抗胃癌作用,本研究通过探讨circYAP1在胃癌组织中的表达,观察其对胃癌细胞生物学行为的影响。探讨circYAP1在胃癌细胞中的作用机制,并探讨川楝素介导circYAP1调控胃癌细胞增殖、侵袭的分子机制。方法:1.通过CircNet网站筛选出circYAP1,通过qPCR和FISH检测其在胃癌组织和胃癌组织芯片中的表达,进行临床病理特征和预后分析。2.通过CircNet和Circular RNA Interactome预测出circYAP1与miR-367-5p相结合,通过circRIP实验和环状RNA与miRNA共定位实验对其验证。3.在胃癌细胞中过表达或敲低circYAP1的表达,通过CCK-8、EdU、克隆形成、Transwell、细胞营救实验等验证circYAP1对胃癌细胞生物行为的影响。4.通过Targetscan预测P27Kip1是miR-367-5p的靶基因,通过luciferase验证miR-367-5p与P27Kip1的关系,WB验证其表达。5.敲低环状RNA后,用川楝素处理细胞,验证川楝素对胃癌细胞增殖和侵袭的作用。研究结果:1.qPCR和FISH检测发现circYAP1在胃癌组织中低表达,circYAP1的表达与胃癌患者的预后呈正相关,多因素Cox回归分析表明circYAP1是胃癌患者的独立预后因素。2.过表达circYAP1能抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和肿瘤的生长。敲低circYAP1能促进胃癌细胞的增殖、侵袭。功能分析发现circYAP1通过吸附miR-367-5p调控P27Kip1的表达。3.TSN能抑制circYAP1敲低对胃癌细胞增殖、侵袭的促进作用,可能与TSN能上调circYAP1的表达有关。结论:circYAP1在胃癌组织中低表达,是胃癌患者独立的预后因子。circYAP1能抑制胃癌细胞增殖和侵袭。circYAP1通过吸附miR-367-5p调节P27Kip1调控胃癌细胞的生物学行为。川楝素能抑制胃癌的增殖和侵袭,川楝素抗胃癌的机制可能与上调circYAP1和P27Kip1的表达相关。
公丕海[8]（2019）在《UCA1/miR-203/ZEB2轴对胃癌侵袭转移作用及其机制的研究》文中研究表明背景:胃癌是肿瘤致死率全球排名第二的肿瘤,也是中国人群常发的恶性肿瘤。近年尽管人们在手术、化疗、放疗等治疗手段上做出了很多的改进,然而全球胃癌患者的平均五年存活率仍在10%以下。其中,肿瘤的复发和转移是胃癌治疗的最大障碍。研究者们已经从多个层面阐述胃癌发病的分子机制,包括基因突变、基因拷贝数变异、基因选择性剪切、基因融合、nc RNA以及表观遗传调控异常等等,但对胃癌的发生发展以及转移的具体分子机制仍然不清楚。近年研究发现,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的调控作用。随着对lnc RNA结构解析和功能研究的深入,研究者发现lnc RNA在胃癌中以多种机制参与调控胃癌细胞的多种生物学功能,有望成为胃癌诊治的新的候选靶分子。目的:本研究以lnc RNA UCA1为候选分子,探讨UCA1在胃癌进展中的生物学作用及其分子调控网络,以期深入理解lnc RNA在胃癌发生发展中的贡献。方法:1.采用基于R语言的limma包分析GEO数据库中胃癌组织样本lnc RNA芯片表达矩阵,下载The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中的胃癌组织测序数据,利用基于R语言的edge R包分析UCA1差异表达情况;通过q PCR的实验方法检测UCA1在60对胃癌病例组织中的表达情况,分析UCA1的表达水平与胃癌临床病理参数之间的相关性,通过q PCR的实验方法检测UCA1在胃癌细胞系中的表达水平;利用RNA-seq技术对干扰UCA1之后的胃癌细胞系BGC-823进行转录组测序,以基因本体（Gene Ontology,GO）分析寻找UCA1可能参与的信号通路。2.通过慢病毒技术建立稳定干扰和过表达UCA1的细胞模型,应用划痕实验和Transwell小室实验检测UCA1在体外对胃癌细胞系迁移和侵袭的影响,利用小鼠尾静脉注射实验研究UCA1在体内对胃癌细胞系迁移的影响,HE染色检测转移灶的形成,q PCR和Western Blot检测迁移相关分子标志物的变化。3.细胞核、细胞质RNA分离实验研究UCA1在细胞中的定位,生物信息学方法构建UCA1参与的吸附调控网络,寻找UCA1通过吸附mi RNA的方式影响的靶分子,并且通过luciferase实验、RNA pull down实验证明UCA1和mi R-203的物理结合,luciferase实验证明mi R-203对ZEB2的抑制是否通过结合ZEB2的3′UTR,RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验证明mi R-203是否通过Ago-2途径抑制ZEB2表达水平。通过q PCR和Western Blot拯救实验研究UCA1对ZEB2的调控是否依赖于吸附mi R-203。结果:1.分析本课题组已获得的胃癌差异表达lnc RNA芯片结果和GEO数据集中2个独立的lnc RNA表达谱,发现lnc RNA UCA1的表达水平明显升高,且排位第一。TCGA数据库中进一步验证了UCA1的表达趋势与以上芯片结果分析相同。2.在60对新鲜胃癌病例组织中分析UCA1的表达水平,发现UCA1在胃癌肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织（p<0.001）,UCA1在胃癌组织中的平均表达水平是癌旁组织的18倍。分析UCA1的表达水平与胃癌临床病理参数之间的相关性,发现UCA1的表达水平与胃癌的淋巴结转移（p=0.038）和年龄（p=0.027）呈现明显的相关性。3.通过RNA-seq技术对干扰UCA1之后的胃癌细胞系BGC-823进行测序,GO分析寻找UCA1可能参与的信号通路,结果显示,干扰UCA1之后,细胞信号通路的变化主要集中在adhesion、adhesion junction、anchoring junction。4.在胃癌细胞系BGC-823中过表达UCA1可以诱导细胞产生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）表型。在过表达UCA1的胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901中,以Western Blot检测与EMT相关的经典标志物发现,Epithelial marker（E-cadherin和β-catenin）明显降低,而Mesenchymal marker（Vimentin和N-cadherin）明显上升。5.划痕实验、Transwell小室实验结果显示,过表达UCA1之后会促进胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的迁移和侵袭能力;敲低UCA1表达会抑制胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823的迁移和侵袭能力。6.裸鼠尾静脉注射实验证明在胃癌细胞系SGC-7901中过表达UCA1之后可以明显的促进胃癌细胞的肝转移,相反,在胃癌细胞系BGC-823中敲低UCA1的表达之后可以明显的抑制胃癌细胞的肝转移。7.细胞核/细胞质分离实验发现UCA1主要定位在细胞质中。通过构建UCA1参与的吸附网络,结合在胃癌细胞系BGC-823中干扰UCA1之后的测序结果,挑选受UCA1影响的候选靶分子ZEB2,干扰UCA1之后在转录水平和蛋白水平均可以抑制ZEB2的表达,而过表达UCA1之后可以提高ZEB2的表达水平。通过吸附调控网络发现UCA1对ZEB2的调控是通过吸附mi R-203,从而解除了mi R-203对ZEB2的抑制作用。8.Luciferase实验、RNA pull down实验表明UCA1和mi R-203是物理结合,luciferase实验显示mi R-203通过结合ZEB2的3′UTR抑制ZEB2的表达,RIP实验表明mi R-203可以通过Ago-2途径抑制ZEB2表达水平。9.通过拯救实验发现,在稳定过表达UCA1的胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中转染mi R-203 mimics可以使ZEB2的表达水平下调,在稳定干扰UCA1的胃癌细胞系SGC-7901和BGC-823中转染mi R-203 inhibitor之后,可以使ZEB2的表达水平恢复,这些结果提示,UCA1对ZEB2的调控是依赖于吸附mi R-203。结论:1.UCA1在胃癌组织中显着高表达,UCA1的表达水平与胃癌的淋巴结转移呈明显的正相关,提示UCA1有可能成为胃癌诊断和检测疾病进展的生物标志物。2.高表达的UCA1可以促进胃癌细胞的侵袭和转移,结合干扰UCA1测序GO分析结果,提示UCA1有望成为胃癌侵袭转移的治疗靶点。3.UCA1对ZEB2的调控是通过吸附mi R-203实现,UCA1/mi R-203/ZEB2轴的提出有助于深入理解胃癌侵袭转移的发生机制并且为研发新的肿瘤药物提供理论基础。背景:染色体20q13.33区域的扩增与胃癌的发生发展密切相关。linc00659位于20q13.33区域且与结肠癌细胞的生长有关,但与胃癌发生及进展是否相关尚不清楚。目的:染色体20q13.33区段上差异表达的lnc RNA linc00659与胃癌患者生存时间的相关性分析,以及其对胃癌细胞侵袭和迁移的影响研究,为胃癌诊治提供可能的新的诊断标志物和潜在的治疗靶点。方法:1.下载胃癌TCGA表达数据,使用edge R包对染色体区段20q13.33上的lnc RNA进行差异表达分析,并且根据linc00659表达水平将胃癌患者分成linc00659高表达组和linc00659低表达组,分析linc00659表达高低与胃癌患者生存时间之间的相关性,分析linc00659表达高低与胃癌临床分期之间的相关性。2.通过q RT-PCR的方法分析60对胃癌组织和癌旁组织中linc00659的表达水平,分析linc00659与胃癌淋巴结转移之间的相关性。通过q RT-PCR检测linc00659在胃癌细胞系中的表达情况。3.通过GSEA富集分析linc00659高表达组和linc00659低表达组之间细胞通路的变化,以推测linc00659参与胃癌发生发展过程的细胞生物学功能。4.稳定干扰linc00659在胃癌细胞系AGS和MKN-74中的表达,通过划痕实验和Transwell小室实验研究linc00659表达抑制对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1.经过分析发现,20q13.33染色体区段含有18条lnc RNA,其中4条lnc RNARTEL1-TNFRSF6B,linc00659,SLCO4A1-AS1,ZBTB46-AS1存在差异表达,其中linc00659与胃癌患者的生存时间有相关性。通过分析TCGA数据库中的胃癌临床病理信息发现,linc00659的表达水平与肿瘤的分期有明显的相关性。2.q RT-PCR方法检测linc00659在60对新鲜胃癌组织和癌旁组织中的表达水平,结果发现,与癌旁组织相比较,linc00659在癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,并且在有淋巴结转移的胃癌病例组织中,癌组织中linc00659的表达水平明显高于癌旁组织。3.与胃粘膜永生化细胞GES-1相比,linc00659在胃癌细胞系中均表达上调。4.基于生物信息学的分析,推测linc00659可能主要参与细胞黏附相关的通路。5.划痕和Transwell小室实验显示,干扰linc00659之后胃癌细胞系AGS和MKN-74的侵袭和迁移的能力受的明显的抑制。结论:linc00659在胃癌组织和胃癌细胞系中均为高表达,提示linc00659在胃癌的发生发展中可能起癌基因的作用。linc00659的高表达与胃癌患者的淋巴结转移和临床分期呈正相关,与患者预后不良有关。linc00659可能参与胃癌细胞的迁移和侵袭能力。
陈静[9]（2019）在《抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究》文中进行了进一步梳理胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第4大肿瘤死因,多数患者就诊时已是晚期。化疗虽然能够适当的使肿瘤患者的生存期延长,但是其副作用较为明显。随着对胃癌的各种信号通路的逐渐认识,在分子水平抑制肿瘤生长的治疗受到人们越来越多的关注。胃癌是一种异质性疾病,分子靶点较少。近年来研究发现BAP31是一种新的肿瘤相关抗原,在多种癌症中高表达,并且可以促进一些癌症的发生发展。本文通过Oncomine和GCBI数据库分析发现BAP31在胃癌组织中高表达,胃癌细胞中也验证了此结果。通过抗体芯片分析BAP31与肿瘤相关因子的关系,发现BAP31与p27kip1呈负相关,与EpCAM呈正相关。进一步研究发现BAP31与p27kip1相互作用并且调节其蛋白酶体降解。p27kip1在细胞的生长发育中扮演重要角色,除了调节细胞周期进程,在细胞凋亡与分化中也具有重要作用。抑制p27kip1的降解可能会杀伤胃癌细胞。细胞内抗体是指将小分子抗体基因添加定位信号序列,使其在细胞内特定部位表达,可以中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或触发免疫反应。细胞内抗体技术作为一种新的基因治疗手段,在神经系统疾病、肿瘤及HIV/AIDS等治疗方面展示了广泛的应用前景。本文利用噬菌体展示技术从人源单域抗体库中筛选得到BAP31的特异性单域抗体基因,添加内质网信号序列,成功构建了内质网滞留型的胞内抗体。其中VH-D1可以特异地阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制p27kip1的蛋白酶体降解。本文对VH-D1是否通过抑制p27kipl降解而杀伤胃癌细胞进行了研究。通过体内外实验,结果显示VH-D1通过抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,抑制了胃癌细胞异种移植在裸鼠体内的生长。胃癌干细胞,是胃癌复发和转移的主要原因。CD44是最早发现的胃癌干细胞标志物。近年来研究发现,CD47也可以作为胃癌干细胞的一个标记物。利用流式细胞分离技术分离出CD44+CD47high细胞。通过Real-Time PCR、Western blot及细胞克隆球形成实验,证明CD44+CD47high具有胃癌干细胞特性。考察VH-D1对胃癌干样细胞的杀伤作用,结果显示,VH-D1可以抑制胃癌干样细胞的干性相关因子的表达,并且抑制了其自我更新和增殖能力。此外,BAP31胞内抗体VH-F12可以特异性的降低EpCAM的表达,诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期,并且诱导细胞产生自噬,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。综上所述,本论文的研究结果证明,BAP31的胞内抗体VH-D1通过阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制了p27kip1的蛋白酶体降解,使胃癌细胞周期阻滞在G1期并且诱导了胃癌细胞的凋亡,抑制了胃癌细胞在鼠内的生长,VH-D1还可以抑制胃癌干样细胞的增殖和更新。此外,VH-F12可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞产生自噬。为胃癌的治疗策略提供了新的思路和理论基础。
郑小华[10]（2017）在《PRL-3与RhoC在胃癌发生发展中作用的研究》文中提出目的:探讨癌旁正常组织、癌前病变组织及不同病理分期的胃癌组织中肝细胞再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3）及Rho C的表达差异及相关性,并进一步分析两者与胃癌浸润、转移及预后的关系。方法:收集右江民族医学院附属医院2011年1月-2016年4月期间行胃癌根治术并且术后明确诊断为胃癌的患者80例,其中2011年1月-2012年10月间胃癌术后的患者60例,2015年9月-2016年4月间胃癌术后的患者20例。另外收集我院消化内镜室胃镜下夹取的50例胃溃疡患者的病变组织,经病检证实夹取的为高级别上皮内瘤变的癌前病变组织。对照组为癌旁正常组织,病例组为胃癌组织和癌前病变组织。采用荧光定量Real-time PCR和免疫组化技术检测癌前病变组、胃癌组及其对应的癌旁组中PRL-3及RhoC的mRNA和蛋白表达情况。结合临床病理及随访资料,分析两者的表达与患者预后的关系。结果:（1）PRL-3的mRNA在胃癌组的相对表达量为（3.45±1.21）,高于其对应的癌旁组的表达（0.84±0.12）及其在癌前病变组的表达（1.42±0.65）（均P<0.05）;RhoC的mRNA在胃癌组的相对表达量为（3.62±1.35）,高于其对应的癌旁组的表达（0.87±0.18）及其在癌前病变组的表达（1.51±0.83）（均P<0.05）。（2）PRL-3的蛋白在胃癌组的阳性表达率为75%,高于其在癌旁组的阳性表达率25%及在癌前病变组的阳性表达率58%;胃癌组中RhoC的蛋白阳性表达率为77.5%,高于其在癌旁组的阳性表达率21.25%及癌前病变组的阳性表达率40%（均P<0.05）。（3）PRL-3与RhoC在胃癌组织中的基因和蛋白表达水平与胃癌患者的分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移密切相关（均P<0.05）,且两者的表达呈正相关（PRL-3:rs=0.726,P<0.05;RhoC:rs=0.740,P<0.05）。（4）Kaplan-Meier生存曲线分析及Log-rank检验显示,PRL-3与RhoC阴性表达组的生存率明显高于两者阳性表达组患者的生存率（PRL-3:P=0.032;RhoC:P=0.014）。结论:（1）PRL-3与RhoC的mRNA和蛋白在胃癌组织中高表达,与胃癌的侵袭和转移密切相关,并且两者的表达呈正相关性,表明两者对胃癌的发生发展起着重要的作用。（2）从正常胃粘膜病变为癌前病变组织,最终发展为胃癌,这一过程中PRL-3与RhoC的基因和蛋白表达水平呈递增趋势,因此联合检测两者的表达情况有助于提高早癌诊断率,两者有望成为胃癌早期诊断的标记物。（3）PRL-3与RhoC的蛋白表达与胃癌患者的预后紧密相关,PRL-3与RhoC阳性表达组患者的年生存率明显低于阴性表达组,因此两者可作为评估胃癌预后有意义的风险因素。
二、p27~(kip1)在胃癌中的表达及与临床病理分期和预后的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p27~(kip1)在胃癌中的表达及与临床病理分期和预后的关系（论文提纲范文）
（1）hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CircRNAS的分类和特征 |
| 1.2.1 circRNAs的分类和生物发生 |
| 1.2.2 circRNAs的特征 |
| 1.3 CIRCRNAS在胃癌中的作用机制和生物学功能 |
| 1.3.1 胃癌中circRNAs的表达概况 |
| 1.3.2 circRNAs在胃癌中的作用机制 |
| 1.3.3 circRNAs对胃癌细胞生物学功能的影响 |
| 1.3.4 circRNAs在 GC中发挥作用的信号通路 |
| 1.3.5 外泌体circRNAs在 GC中的功能 |
| 1.3.6 circRNAs研究的公共数据库 |
| 1.4 CircRNAS在胃癌中的应用 |
| 1.4.1 circRNAs作为胃癌的生物标志物 |
| 1.4.2 circRNAs作为GC治疗靶点 |
| 1.4.3 外泌体circRNAs在 GC诊断和治疗中的应用价值 |
| 1.5 问题和展望 |
| 第2章 胃癌中差异表达的CIRCRNAS |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 患者和样本收集 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 分离外泌体 |
| 2.3.2 透射电子显微镜(TEM)观察外泌体形态 |
| 2.3.3 Western blot检测外泌体标志物 |
| 2.3.4 提取外泌体RNA |
| 2.3.5 RNA文库构建和测序 |
| 2.3.6 鉴定差异表达的circRNA |
| 2.3.7 GO(Gene ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)分析 |
| 2.3.8 逆转录实时定量 PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血浆外泌体的分离和鉴定 |
| 2.4.2 GC患者血浆外泌体中差异表达的circRNA |
| 2.4.3 DE circRNA的 GO和 KEGG富集 |
| 2.4.4 RT-qPCR验证DE circRNA的表达 |
| 2.4.5 GC患者血浆外泌体中hsa_circ_0014606 的表达水平与肿瘤大小和浸润深度正相关 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中发挥促癌作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 hsa_circ_0014606 序列分析 |
| 3.3.2 慢病毒包装和感染 |
| 3.3.3 GC细胞增殖实验 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 划痕愈合实验 |
| 3.3.6 Transwell实验 |
| 3.3.7 THP-1 细胞分化和极化实验 |
| 3.3.8 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 hsa_circ_0014606 的亲本基因和剪接结构 |
| 3.4.2 hsa_circ_0014606在GC细胞中的过表达和敲减 |
| 3.4.3 过表达hsa_circ_0014606 促进GC细胞增殖和存活 |
| 3.4.4 hsa_circ_0014606 促进GC细胞迁移和侵袭 |
| 3.4.5 外泌体hsa_circ_0014606 促进THP-1 细胞向M2 巨噬细胞方向极化 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 HSA_CIRC_0014606 在胃癌中的作用靶标 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞和实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 靶标miRNA和 mRNA预测 |
| 4.3.2 RT-qPCR |
| 4.3.3 荧光素酶报告实验 |
| 4.3.4 NCG小鼠体内成瘤实验 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 预测的靶标miRNA |
| 4.4.2 hsa_circ_0014606 对候选靶标miRNA表达水平的影响 |
| 4.4.3 hsa_circ_0014606 可与miRNA-194-5p直接结合 |
| 4.4.4 YAP1是miRNA-194-5p的靶基因 |
| 4.4.5 hsa_circ_0014606 促进GC细胞NCD小鼠体内成瘤 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于转录组学及蛋白组学寻找胃癌预后预测因子并进行本地验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 转录组学数据来源 |
| 2.1.2 蛋白组学数据来源 |
| 2.1.3 临床标本收集 |
| 2.1.4 主要应用软件及程序包 |
| 2.1.5 主要仪器设备及软件 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 数据预处理及清洗 |
| 2.2.2 筛选胃癌预后相关分子指标 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色实验(Immunocytochemistry,IHC) |
| 2.2.4 免疫组化染色评分 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 建立整合数据集,筛选胃癌预后相关基因 |
| 3.2 TCGA数据集中ZNF326 与其他基因的共表达分析及通路富集 |
| 3.3 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)的关系 |
| 3.4 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)相关性 |
| 3.5 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与肿瘤干细胞相关性分析 |
| 3.6 组织芯片验证胃癌患者组织中ZNF326 的表达情况 |
| 3.7 组织芯片ZNF326 表达水平与临床病理资料的关系 |
| 3.8 组织芯片ZNF326 表达水平与胃癌患者预后的关系 |
| 3.8.1 ZNF326 表达水平与全组患者的生存分析 |
| 3.8.2 亚组分析——肿瘤大小 |
| 3.8.2 亚组分析——组织分型 |
| 3.8.3 亚组分析——组织分化 |
| 3.8.4 亚组分析——TNM分期 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:ZNF326 在人胃癌细胞系中的体内外功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.1.4 抗体列表 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒载体及慢病毒载体 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.3 实验研究方法 |
| 2.3.1 质粒的构建、转化与提取 |
| 2.3.2 细胞系培养 |
| 2.3.3 稳转细胞系构建 |
| 2.3.4 Trizol法提取total RNA实验 |
| 2.3.5 cDNA反转录实验 |
| 2.3.6 Real-time PCR实验 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.8 全蛋白提取 |
| 2.3.9 BCA法蛋白定量 |
| 2.3.10 Western Blot实验 |
| 2.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 2.3.12 Transwell小室侵袭实验(以六孔板一孔细胞为例) |
| 2.3.13 CCK8 细胞增殖实验 |
| 2.3.14 细胞划痕实验(以12 孔板一孔为例) |
| 2.3.15 裸鼠成瘤及观察实验 |
| 2.3.16 裸鼠肺转移模型建立及观察实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 稳筛细胞株的构建和ZNF326 在细胞系中的表达定位 |
| 3.2 ZNF326 影响胃癌细胞的迁移能力 |
| 3.3 ZNF326 影响胃癌细胞的侵袭能力 |
| 3.4 ZNF326 表达水平改变对EMT指标的影响 |
| 3.5 ZNF326 影响胃癌细胞的增殖能力 |
| 3.6 ZNF326 影响胃癌细胞裸鼠皮下成瘤 |
| 3.7 ZNF326 影响胃癌细胞裸鼠肺转移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 胃癌患者预后分子指标研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）ZYX促进胃癌侵袭转移作用机制及在胶质瘤细胞侵袭中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 ZYX在胃癌组织中的表达及其临床病理学意义 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 ZYX促进胃癌细胞的迁移、侵袭和转移 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 ZYX激活WNK1/Snail通路诱导胃癌细胞EMT的产生 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 ZYX促进胶质瘤细胞的体外迁移和侵袭能力 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ZYX在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于GEO及 TCGA生物信息学分析探究胃癌差异基因 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生信分析数据库及工具选取 |
| 2.2 分析流程及步骤 |
| 2.2.1 GEO芯片下载 |
| 2.2.2 筛选表达差异基因 |
| 2.2.3 GO/KEGG功能富集及注释 |
| 2.2.4 蛋白互作分析 |
| 2.2.5 GEPIA数据库验证差异基因表达 |
| 2.2.6 Kaplan-Meier plotter探究基因预后价值 |
| 3 结果 |
| 3.1 GSE79973差异基因表达 |
| 3.2 蛋白互作PPI筛选5个粘附相关基因 |
| 3.3 GEPIA数据库验证差异基因表达情况 |
| 3.4 五种差异表达基因的预后价值 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LAMC1在胃癌发生发展中的重要作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 免疫组化 |
| 2.1.1 原理 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.1.3 实验步骤 |
| 2.1.4 免疫组化评分原则 |
| 2.1.5 临床数据统计及分析 |
| 2.2 细胞培养、冻存与复苏 |
| 2.2.1 实验试剂及耗材 |
| 2.2.2 细胞传代培养 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.3 细胞转染技术 |
| 2.3.1 siRNA或 miRNA mimic/inhibitor瞬时转染: |
| 2.3.2 病毒稳定转染 |
| 2.4 Western Blotting |
| 2.4.1 实验试剂及仪器 |
| 2.4.2 配制电泳液、转膜液及SDS-PAGE凝胶 |
| 2.4.3 蛋白样品收集 |
| 2.4.4 Western blotting主要流程 |
| 2.5 CCK-8实验 |
| 2.5.1 原理 |
| 2.5.2 实验步骤 |
| 2.6 细胞周期实验 |
| 2.6.1 原理 |
| 2.6.2 实验试剂及器材 |
| 2.6.3 实验步骤 |
| 2.7 EdU增殖实验 |
| 2.7.1 原理 |
| 2.7.2 实验试剂及器材 |
| 2.7.3 实验步骤 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.8.1 原理 |
| 2.8.2 实验试剂及耗材 |
| 2.8.3 实验步骤 |
| 2.9 小鼠皮下成瘤实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化提示LAMC1在胃癌组织中呈高表达 |
| 3.2 敲低LAMC1,细胞增殖、侵袭转移能力明显下降 |
| 3.3 LAMC1 可影响ERK1、EMT等相关通路蛋白表达 |
| 3.4 体内实验证实,LAMC1低表达细胞系的成瘤能力明显下降 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 KLF4 通过miR-195-5p靶向调控LAMC1 表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 生物信息学预测分析 |
| 2.1.1 miRNA基因预测 |
| 2.1.2 转录因子与启动子靶点预测 |
| 2.2 质粒转染 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 real-time PCR |
| 2.3.1 实验试剂与仪器 |
| 2.3.2 引物序列 |
| 2.3.3 实验步骤 |
| 2.4 双荧光素酶实验 |
| 2.4.1 原理 |
| 2.4.2 实验试剂与仪器 |
| 2.4.3 实验步骤 |
| 2.5 染色质免疫沉淀实验 |
| 2.5.1 原理 |
| 2.5.2 实验试剂 |
| 2.5.3 实验步骤 |
| 2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.6.1 实验试剂 |
| 2.6.2 实验步骤 |
| 3 结果 |
| 3.1 LAMC1是miR-195-5p下游潜在靶基因 |
| 3.2 miR-195-5p可靶向抑制LAMC1 蛋白表达 |
| 3.3 KLF4 可促进miR-195-5p并抑制LAMC1 表达 |
| 3.4 KLF4 可靶向结合miR-195-5p启动子区域 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 NUB1蛋白在胃癌及癌旁样本中的表达情况的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂(盒)及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配置方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 患者病理样本收集 |
| 2.2.2 石蜡组织切片制作 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.2.4 组化结果评分 |
| 2.2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NUB1蛋白在胃癌及对应的癌旁组织中的表达情况 |
| 3.2 NUB1蛋白的表达与临床病理特征之间的关系 |
| 3.3 NUB1蛋白表达与胃癌患者淋巴结阳性率之间的关系 |
| 3.4 NUB1蛋白表达与患者预后生存的关系 |
| 3.5 NUB1蛋白表达的预后价值(包括单因素及多因素分析) |
| 3.6 NUB1的m RNA表达与患者预后的关系 |
| 4 结论 |
| 第二部分 细胞实验研究NUB1调控胃癌恶性表型的作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂(盒)及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配置方法 |
| 2.1.4 主要胃癌细胞系及转染病毒的信息 |
| 2.1.5 主要引物序列 |
| 2.1.6 主要抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 正常胃粘膜细胞系及胃癌细胞系的培养 |
| 2.2.2 病毒转染 |
| 2.2.3 实时定量PCR(RT-PCR)实验 |
| 2.2.4 蛋白质印迹实验 |
| 2.2.5 细胞增殖实验(CCK-8实验) |
| 2.2.6 细胞迁移实验(体外划痕实验) |
| 2.2.7 细胞侵袭实验(预置基质胶Transwell实验) |
| 2.2.8 流式细胞实验(荧光细胞激活分选实验) |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NUB1基因在正常胃粘膜细胞系及胃癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2 NUB1基因在胃癌细胞系中构建过表达细胞模型 |
| 3.3 NUB1基因对胃癌细胞系增殖活性的影响 |
| 3.4 NUB1基因对胃癌细胞周期的调控作用 |
| 3.5 NUB1 基因对抑癌基因p27Kip1 的影响 |
| 3.6 NUB1基因对胃癌细胞迁移性的影响 |
| 3.7 NUB1基因对胃癌细胞侵袭性的影响 |
| 3.8 NUB1基因对上皮-间质转化过程中相关蛋白表达的影响 |
| 4 结论 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Norrin对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及可能机制（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 Norrin在正常胃黏膜上皮细胞系和各胃癌细胞系中的表达含量 |
| 3.2 Norrin在胃癌组织中的表达及与胃癌患者临床病理资料和预后的关系 |
| 3.3 构建干扰Norrin表达的XN0422 胃癌细胞株 |
| 3.4 干扰Norrin对 XN0422 细胞内经典Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.5 干扰Norrin对 XN0422 细胞内AKT信号通路的影响 |
| 3.6 Norrin可通过AKT信号通路促进XN0422 细胞增殖 |
| 3.7 Norrin可通过AKT信号通路促进XN0422 细胞侵袭转移 |
| 4.讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Wnt、AKT、MAPK信号通路与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）川楝素介导circYAP1调控胃癌生长的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照 |
| 绪论 |
| 第一部分 CircYAP1 在胃癌中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 过表达circYAP1 对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 敲低circYAP1 的表达对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 川楝素介导circYAP1 调控胃癌细胞的研究 |
| 引言 |
| 材料及方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间已发表的论文 |
（8）UCA1/miR-203/ZEB2轴对胃癌侵袭转移作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 第一章 lncRNA-UCA1 在胃癌组织中差异表达分析 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 分析工具 |
| 2.实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 数据库分析胃癌组织细胞中差异lncRNA基因表达谱 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 UCA1对胃癌细胞迁移侵袭能力影响的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系及载体 |
| 1.2 临床胃癌患者组织标本 |
| 1.3 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 胃癌病例组织及细胞中的总RNA提取 |
| 2.3 逆转录及荧光定量PCR |
| 2.4 LncRNAs siRNA的合成及慢病毒载体的构建 |
| 2.5 转染 |
| 2.6 细胞划痕实验检测UCA1 对细胞迁移能力的影响 |
| 2.7 Transwell实验检测UCA1 对细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 2.8 小鼠尾静脉注射实验 |
| 2.9 RNA sequencing |
| 2.10 总蛋白的提取 |
| 2.11 Western Blot实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 lncRNA-UCA1 在胃癌临床病理组织及胃癌细胞系中的表达水平分析 |
| 3.2 lncRNA-UCA1 促进胃癌细胞的侵袭和转移 |
| 3.3 体外实验研究UCA1 对胃癌细胞的侵袭和转移能力的影响 |
| 3.4 胃癌转移过程中经典黏附因子的检测 |
| 3.5 体内实验研究UCA1 对胃癌细胞转移能力的影响 |
| 3.6 lncRNA-UCA1 诱导了胃癌细胞EMT样细胞形态出现 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 UCA1 参与胃癌侵袭转移的分子机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 RNA提取、逆转录及q PCR |
| 2.2 RNA-pull down |
| 2.3 RIP实验 |
| 2.4 荧光素酶报告基因分析 |
| 2.5 胃癌细胞中UCA1细胞核质比分析 |
| 2.6 Western Blot |
| 2.7 划痕实验 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UCA1 在细胞质和细胞核中的分布比例 |
| 3.2 UCA1 上调了ZEB2 的表达 |
| 3.3 UCA1 吸附了mi R-203 |
| 3.4 miR-203对ZEB2 的抑制是基于Ago-2 依赖的途径 |
| 3.5 miR-203 可以抑制胃癌细胞的迁移能力 |
| 3.6 UCA1对ZEB2 的调控是通过竞争结合mi R-203 实现 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 第一部分 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 linc00659 对胃癌细胞转移能力影响的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系及慢病毒载体 |
| 1.2 临床胃癌患者组织标本 |
| 1.3 胃癌TCGA数据 |
| 1.4 GSEA分析 |
| 1.5 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 位于20q13.33的linc00659 显着高表达 |
| 3.2 linc00659 在胃癌临床病例组织及胃癌细胞系中的表达水平分析。 |
| 3.3 linc00659 促进胃癌细胞的迁移和侵袭 |
| 小结 |
| 第二部分 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 文献综述 lncRNA在胃癌中的研究进展 |
| 前言 |
| 1、非编码RNA与肿瘤 |
| 2、lncRNA与肿瘤 |
| 3、UCA1 在胃癌中的研究现状 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 简介 |
（9）抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的现状 |
| 1.1.2 胃癌的发病机制 |
| 1.1.3 胃癌的治疗方法 |
| 1.2 BAP31 |
| 1.2.1 BAP31的结构 |
| 1.2.2 BAP31的功能 |
| 1.2.3 BAP31在癌症中的作用 |
| 1.3 细胞内抗体(Intracellular antibody,intrabody) |
| 1.3.1 抗体药物的发展及其分类 |
| 1.3.2 常用抗体库技术 |
| 1.3.3 细胞内抗体的分类应用 |
| 1.4 本文的主要研究内容和意义 |
| 第2章 BAP31在胃癌中的作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BAP31在多种癌症中高表达 |
| 2.3.2 BAP31在胃癌组织及胃癌细胞系中高表达 |
| 2.3.3 BAP31与周期蛋白p27~(kipl)负相关 |
| 2.3.4 BAP31调节p27~(kipl)蛋白酶体降解并与其结合 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 本章讨论 |
| 2.4.2 本章小结 |
| 第3章 抗BAP31 VH抗体的筛选及胞内抗体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BAP31 VH单域抗体基因的筛选 |
| 3.3.2 内质网滞留型细胞内抗体的构建 |
| 3.3.3 VH-D1通过与BAP31的C末端特异性结合,阻碍了其与p27~(kip1)的相互作用 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 本章讨论 |
| 3.4.2 本章小结 |
| 第4章 VH-D1在体内外抗肿瘤效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 VH-D1抑制GC细胞增殖 |
| 4.3.2 VH-D1阻滞GC细胞周期在G1期 |
| 4.3.3 VH-D1诱导GC细胞凋亡 |
| 4.3.4 VH-D1在体内对GC细胞的杀伤作用 |
| 4.3.5 VH-D1感染的细胞对小鼠的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第5章 VH-D1诱导GC干细胞分化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 GC干样细胞的富集与鉴定 |
| 5.3.2 胞内抗体VH-D1对CD44~+CD47~(high)细胞的影响 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第6章 VH-F12通过诱导MKN-45细胞自噬引起死亡 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 EpCAM在胃癌组织中高表达 |
| 6.3.2 VH-F12抑制EpCAM的表达 |
| 6.3.3 VH-F12诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期 |
| 6.3.4 VH-F12诱导MKN-45细胞死亡 |
| 6.3.5 VH-F12引起MKN-45细胞自噬 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第7章 总结与创新点 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 作者从事科学研究和学习经历的简历 |
（10）PRL-3与RhoC在胃癌发生发展中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 英汉缩略词对照表 前言 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 实验所用主要耗材、试剂及仪器 |
| 1.2.2 实验溶液的配置 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 免疫组化法 |
| 1.3.2 实时荧光定量RT-PCR |
| 1.3.3 统计学分析 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR实验结果 |
| 2.1.1 PRL-3 与 Rho C 的 m RNA 在胃癌、癌前病变组织和癌旁组织的表达情况 |
| 2.1.2 PRL-3 与RhoCm RNA的表达与胃癌临床病理学特征关系 |
| 2.1.3 PRL-3 与RocCmRNA表达的相关性分析 |
| 2.2 免疫组化实验结果 |
| 2.2.1 PRL-3 和 Rho C 蛋白在胃癌、癌旁组织及癌前病变组织的表达情况 |
| 2.2.2 PRL-3 与RhoC蛋白的表达与胃癌临床病理学特征关系 |
| 2.2.3 PRL-3 与RhoC蛋白表达的相关性分析 |
| 2.2.4 PRL-3 与RhoC蛋白的表达与胃癌的预后关系 3 讨论 |
| 3.1 PRL-3 与胃癌的关系 |
| 3.2 RhoC与胃癌的关系 |
| 3.3 PRL-3 与RhoC在胃癌中的作用关系 |
| 3.4 不足与展望 结论 参考文献 综述 |
| 参考文献 致谢 个人简介及攻读硕士学位期间获得的科研成果 |
四、p27~(kip1)在胃癌中的表达及与临床病理分期和预后的关系（论文参考文献）
- [1]hsa＿circ＿0014606在肿瘤细胞内及外泌体中调节胃癌发生发展的功能和机制研究[D]. 饶敏. 吉林大学, 2021(01)
- [2]胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究[D]. 吕星儿. 中国医科大学, 2021
- [3]ZYX促进胃癌侵袭转移作用机制及在胶质瘤细胞侵袭中的作用[D]. 蒋易. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [4]“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制[D]. 高梓茗. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]转录因子NUB1调控胃癌恶性生物学行为的分子机制研究[D]. 张冬冬. 中国医科大学, 2020
- [6]Norrin对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及可能机制[D]. 刘磊. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [7]川楝素介导circYAP1调控胃癌生长的分子机制研究[D]. 刘辉. 上海交通大学, 2019(06)
- [8]UCA1/miR-203/ZEB2轴对胃癌侵袭转移作用及其机制的研究[D]. 公丕海. 东南大学, 2019
- [9]抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究[D]. 陈静. 东北大学, 2019(01)
- [10]PRL-3与RhoC在胃癌发生发展中作用的研究[D]. 郑小华. 右江民族医学院, 2017(01)