一、腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究（论文文献综述）
武静桥[1]（2021）在《共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究》文中认为肝细胞癌（HCC）异质性、死亡率和转移程度高,以血管增生为主要特征。早期患者临床症状不明显,晚期难以治愈,临床治疗较为棘手。人和动物患病率都逐年升高,耐药现象不断增加,因此,具靶向性的基因治疗成为肝癌治疗的研究热点。HIV反式激活转录（TAT）蛋白,源自人类HIV病毒TAT蛋白,可穿透细胞膜,促进大分子物质进入细胞质;Apoptin诱导的细胞凋亡受到Bcl-2和Apaf-1凋亡小体的调控,通过激活凋亡小体和Bcl-2调节的死亡途径,同时激活自噬和线粒体凋亡途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡;肿瘤归巢肽RGD能够识别存在于癌细胞表面的整联蛋白,特异性靶向肿瘤的血管区;MEL通过与细胞膜结合,形成跨膜环状孔而使细胞膜破坏,细胞中的物质泄漏,细胞膜通透性增加,最终导致细胞溶解。本课题选择凋亡素Apoptin与蜂毒肽MEL作为肝癌靶向治疗基因,借助腺病毒作为载体,高效传递至靶细胞。将穿膜肽TAT与Apoptin融合表达,促进裂解的肝癌细胞中Apoptin蛋白二次内化进癌细胞;以靶向肽RGD靶向肝癌血管中的整合素受体,使其与MEL融合表达,引导MEL特异性杀伤肿瘤细胞,减轻对正常组织的非特异性损伤。共表达Apoptin与MEL基因,利用Apoptin以线粒体凋亡和自噬特异性诱导杀伤肿瘤细胞,同时,结合MEL溶解癌细胞的细胞膜、破坏细胞的完整结构特性,实现双基因协调抑瘤的目的,为肝癌的基因靶向治疗奠定基础。试验中将pMD-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL基因片段利用高保真特异性扩增,无缝克隆连接至线性化的GV314,构建腺病毒穿梭载体GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL。将腺病毒穿梭载体与大骨架质粒共转染至HEK293A细胞,包装纯化获得的重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin滴度为1010.75 pfu/m L,Ad-RGD-MEL的滴度为1010.38 pfu/m L,TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的滴度为1010.25 pfu/m L,Ad-EGFP的滴度为1011 pfu/m L。将各重组腺病毒分别侵染SMMC-7721细胞,间接免疫荧光和Western Blotting检测到肝癌细胞中目的基因成功表达;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL增加了活性氧的表达含量,促使细胞核DNA碎片化;重组腺病毒对L-02无显着抑制作用,对SMMC-7721与Huh 7细胞抑制作用呈现时间和剂量依赖性;流式细胞术检测1000 MOI重组腺病毒侵染SMMC-7721细胞36 h后,与对照组相比,Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的早期和晚期凋亡率均存在极显着升高（P<0.01）;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL极显着抑制SMMC-7721细胞的迁移,极显着抑制FBS介导的SMMC-7721细胞的侵袭和趋化作用（P<0.01）。重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够延缓裸鼠体重下降趋势;Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL组靶向性强,对正常组织器官损伤小,同时诱导肿瘤与肝脏中Caspase3和P53蛋白表达,凋亡细胞数增多。本实验成功包装了重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL,体外试验结果证实重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够显着抑制SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。经异位瘤模型验证,重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL治疗组肿瘤中P53、Casepase3蛋白表达量增加,延缓裸鼠体重下降趋势,对正常组织无明显杀伤作用。综上所述,本试验表明重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够靶向抑制肝癌细胞,为比较医学和肿瘤靶向治疗提供理论基础。
陈小龙[2]（2021）在《基于质粒的Akt1特异性siRNA和P53共表达协同抑制肝细胞癌细胞的增值、迁移和侵袭》文中认为目的:探讨Akt1特异性si RNA和P53共表达质粒对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。方法:我们构建了一种共表达Akt1特异性si RNA和野生型P53基因的双表达质粒（pSi-Akt1-P53）。将pSi-Akt1-P53共表达质粒转染至肝癌Hep-G2细胞,采用实时荧光定量PCR法和蛋白质免疫印迹法检测细胞中Akt1和P53表达被调控情况。然后将这种共表达质粒转染至Hep G2细胞中,并同sh Akt1质粒和P53质粒相比较,分别采用CCK-8和Ed U实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞术检测其对Hep-G2细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果:pSi-Akt1-P53共表达质粒转染至肝癌Hep-G2细胞后显着地减少Hep-G2细胞中Akt1蛋白的表达量,同时显着增加P53蛋白的表达量。与sh Akt1质粒和P53质粒相比,pSi-Akt1-P53共表达质粒更显着地抑制Hep-G2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时更显着地促进Hep-G2细胞的凋亡。结论:pSi-Akt1-P53共表达质粒能非常显着地抑制肝癌Hep-G2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,有效促进肝癌Hep-G2细胞凋亡。
徐阳[3]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中指出背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
瞿静[4]（2020）在《肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物》文中研究说明肺癌是威胁人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的基因疗法因具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势而备受关注。生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）基因能分别从细胞内、外两条途径抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。腺病毒作为基因传递载体能够高效地传递和表达目的基因,但因存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对固有受体细胞的趋向性等不足,限制了其在临床的广泛应用。柞蚕丝素蛋白具有优异的生物相容性和低免疫原性,并且包含的大量极性氨基酸残基赋予其丰富的化学反应活性和修饰位点。为了进一步提高腺病毒作为ING4-IL-24双基因传递载体的感染效率,以减少其有效使用滴度,降低其毒副作用,同时为了保护腺病毒免受腺病毒血清抗体的中和,本课题研制一种新型的肺癌靶向性的阳离子化柞蚕丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物。通过体外实验和动物实验,研究该复合物对肺癌细胞的靶向感染作用、抑制生长作用、促进凋亡作用,以及对正常组织细胞的毒性。以期使用较低滴度的腺病毒,达到有效的抑制肺癌效果,避免使用高滴度腺病毒的潜在毒副作用。为实现这一目标,本文采用低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性,并在丝素蛋白的侧链接枝肺癌细胞特异性寡肽C9（CSNIDARAC）,用此肺癌细胞靶向的阳离子化柞蚕丝素包被ING4-IL-24双基因共表达腺病毒,获得肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达复合物。体外研究复合物对肺癌细胞H460的靶向作用、感染效率、抑制增殖和诱导凋亡作用,体内研究复合物对小鼠H460肺癌移植瘤的生长抑制作用及抑癌机制,同时通过体外、体内实验,分析和评价复合物对正常细胞脐静脉内皮细胞HUVEC和正常组织的毒副作用。首先,构建ING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体。将ING4-IL-24双基因共表达转移质粒与腺病毒骨架质粒同源重组后感染人胚肾细胞QBI-293A,多次扩增后获得ING4-IL-24双基因共表达腺病毒（Ad）。Western blotting和ELISA测试结果表明,腺病毒能介导外源性的ING4和IL-24基因在人胚肾细胞QBI-293A细胞中表达。其次,在碳二亚胺的介导下,使低分子量聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与柞蚕丝素蛋白（ASF）的羧基偶联后生成酰胺键,获得阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASF）。当参加反应的PEI占柞蚕丝素的质量百分比为4%时,改性后柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位达到+12.03 mV,接枝效率约为86.34%。接着,以3-（2-吡啶二硫）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将肺癌细胞特异性寡肽C9以二硫键的形式接枝到阳离子化柞蚕丝素蛋白的侧链,制得肺癌细胞靶向性柞蚕丝素蛋白（CASF-C9）,实验结果表明,CASF-C9的表面Zeta电位较CASF有所下降。为了初步评价CASF-C9装载基因的能力及其生物学效应,先用CASF-C9包装质粒DNA（pDNA）,制备不同质量比的CASF-C9/pDNA复合物。实验结果显示,CASF-C9与pDNA质量比为64/2、128/2、256/2时,能够完全包裹住质粒DNA。CASF-C9/pDNA复合物转染肺癌细胞H460后表达绿色荧光的细胞数量和转染效率显着高于对照组CASF/pDNA复合物,并且接枝寡肽C9的量越高,表达荧光的细胞数量和基因转染效率越高,CASF-C9/pDNA复合物对H460细胞增殖的抑制作用也更显着。在此基础上,用CASF-C9依靠静电吸附作用包被腺病毒载体,制备肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。从形貌、表面Zeta电位和粒径分布的检测结果可知,复合物呈球形或类球形颗粒,其表面Zeta电位和粒径均随着包覆于腺病毒表面的CASF-C9浓度的增加而增大。对CASF-C9进行异硫氰酸荧光素标记,研究短肽C9对肺癌细胞H460的靶向识别作用。激光共聚焦显微镜观察和分析结果表明,接枝短肽C9的CASF-C9及复合物CASF-C9/Ad均能特异性识别并粘附至肺癌细胞H460的表面,提示复合物CASF-C9/Ad具有肺癌细胞靶向性,具有以较低滴度的复合物达到有效感染肺癌细胞的潜力。进一步,用CASF-C9/Ad复合物体外分别感染肺癌细胞H460和脐静脉内皮细胞HUVEC,检测荧光表达和感染效率。研究结果表明,H460细胞和HUVEC细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的荧光表达强度和感染效率均显着高于对照组裸Ad。H460细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的生长受到了明显的抑制,细胞存活率显着低于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。复合物CASF-C9/Ad中的目的基因ING4和IL-24均能在肺癌细胞H460中有效表达并诱导细胞凋亡。感染复合物CASF-C9/Ad的H460细胞凋亡率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。而与H460细胞完全不同,HUVEC细胞感染CASF-C9/Ad复合物后,其细胞形态和细胞增殖活力均未受到明显的影响。证明CASF-C9/Ad复合物对肺癌细胞具有明显的靶向性和抑制增殖、促进凋亡效应,而对正常细胞无明显毒性。最后,用ING4-IL-24双基因共表达CASF-C9/Ad复合物体内治疗小鼠H460肺癌移植瘤。肺癌移植瘤的体积变化、肿瘤重量、抑瘤率的检测结果证明,CASF-C9/Ad能显着抑制肺癌移植瘤的生长,抑瘤率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织出现大片坏死灶,肿瘤细胞崩解、胞核染色消失,肿瘤细胞发生肿胀,呈空泡化结构,细胞膜出现连续性破坏。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织坏死程度较对照组裸Ad和CASF/Ad复合物更显着。双基因共表达复合物CASF-C9/Ad能够将目的基因ING4和IL-24高效递送至肺癌细胞,通过下调Ki 67、Bcl-2的表达抑制肺癌细胞增殖;通过上调C Caspase-3、Bax的表达促进肺癌细胞凋亡;通过下调VEGF、CD31的表达阻断肿瘤血管新生,多途径实现对小鼠H460肺癌移植瘤的抑瘤效应。本文将肺癌细胞特异性的寡肽CSNIDARAC接枝到柞蚕丝素蛋白侧链,构建能靶向识别和感染肺癌细胞的阳离子化柞蚕丝素蛋白/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。该复合物不仅能靶向、高效地将目的基因递送至肺癌细胞,减少腺病毒的有效使用滴度;也能屏蔽腺病毒与宿主的直接作用,保护腺病毒免受血清抗体的中和,降低腺病毒的免疫原性风险;同时对正常细胞无明显毒性。动物实验证明,复合物CASF-C9/Ad通过抑制肺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡、阻断肿瘤血管新生等多种途径实现抑瘤效应。
胥红斌[5]（2020）在《miR-1203沉默亲环蛋白D拮抗子宫内膜细胞氧糖剥夺再加氧损伤的实验研究》文中认为背景和目的:在产科临床中,产后出血是常见的并发症之一,可引起子宫内膜中度至重度缺血性损伤。而子宫内膜缺血后常伴有再灌注,可导致人子宫内膜细胞明显氧化损伤。在分子水平上,缺血再灌注会引起活性氧簇（ROS）的产生和子宫内膜细胞的过度氧化损伤,导致循环脂质过氧化物的产生和各种抗氧化剂的减少。这些因素将会引起进一步的DNA断裂、蛋白损伤和线粒体功能障碍,最终导致子宫内膜细胞和组织死亡。研究证实亲环蛋白D（Cyp D）依赖性程序性坏死通路介导OGDR对人子宫内膜细胞的细胞毒作用。在体外实验中,常利用氧葡萄糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）和随后的复氧（reoxygenation,OGDR）作用于培养的子宫内膜细胞模型,以模拟机体缺血再灌注和氧化损伤。micro RNAs（mi RNAs）是长约22核苷酸（nt）的内源性非编码RNA（nc RNAs）。mi RNA被证实广泛参与人体各种疾病的发生发展。mi RNAs可以通过直接与3’-非翻译区（3’-UTR）结合来抑制靶向m RNA的翻译和/或表达。在本论文中我们将阐述一种新的鉴定的Cyp D靶向mi RNA,micro RNA-1203（mi R-1203）,我们的结果表明mi R-1203靶向并沉默Cyp D以保护人子宫内膜细胞免受OGDR诱导的程序性坏死。研究方法和内容:通过三种生物信息预测软件（Targetscan,mi Rbase和mi RDB）预测,验证mi R-1203和Cyp D 3’-UTR结合位点,人子宫内膜细胞系T-HESC荧光素酶报告基因验证转染野生型（WT）或两个突变体（Mut1/2）mi R-1203模拟物与Cyp D3’-UTR结合;体外构建pre-mi R-1203慢病毒过表达和干扰载体（lv-pre-mi R-1203/lv-mi RC和lv-antago mi R-1203/anta C）,转染T-HESC和人原代子宫内膜细胞,实时定量聚合酶链反应（q PCR）验证mi R-1203和Cyp D m RNA的表达水平,Western blotting检测Cyp D的蛋白表达变化;分别OGDR诱导后上述稳定mi R-1203过表达和抑制的T-HESC细胞株和人原代子宫内膜细胞后,使用荧光染料DCFH-DA（2’,7’-二氯荧光素乙酸盐）流式细胞术测定ROS水平,JC-1绿色荧光探针检测线粒体去极化,CCK-8（cell counting kit-8）检测细胞活力,Western blotting检测胞浆中细胞色素C的释放,试剂盒检测培养基中LDH的释放。同时在T-HESC细胞株中OGDR不同时间点处理（6h,12h,18h,24h）,检测mi R-1203和Cyp D m RNA的表达水平;使用ROS清除剂NAC（N-acetylcysteine,500μM,1h）预处理T-HESC细胞以及在lv-antago mi R-1203感染的人原代子宫内膜细胞中加入Cyp D阻断剂Cs A后,CCK-8检测细胞活力和培养基LDH释放检测细胞坏死改变;使用CRISPR/Cas9技术完全敲除T-HESC细胞中Cyp D（Cyp D-KO）后分别过表达或抑制mi R-1203表达以及构建UTR-depleted Cyp D载体（UTR-null Cyp D）转染mi R-1203过表达T-HESC细胞,OGDR处理24h后,CCK-8检测细胞活力改变,LDH释放检测细胞坏死,同时q PCR检测mi R-1203表达,Western blotting检测Cyp D蛋白表达;在人原代子宫内膜细胞中,过表达以及抑制mi R-1203表达后,Cyp D抑制剂Cs A预处理,OGDR 24h诱导,LDH释放检测细胞坏死,q PCR检测mi R-1203表达。研究结果:通过生信预测以及荧光素酶报告基因,我们发现mi R-1203靶向Cyp D的3’-UTR（位置为806-813）,T-HESC细胞株和人原代子宫内膜细胞过表达mi R-1203显着抑制Cyp D的m RNA和蛋白表达水平。相反,抑制mi R-1203能明显提高Cyp D表达水平。mi R-1203在子宫内膜细胞中的过表达减轻了OGDR诱导的程序性坏死,抑制了线粒体Cyp D-p53-ANT1（Adenine nucleotide translocator）的关联,线粒体去极化,活性氧的产生和乳酸脱氢酶的释放。相反,OGDR诱导的程序性坏死和细胞毒性随着子宫内膜细胞中mi R-1203的抑制而增强。此外,mi R-1203过表达或抑制未能改变OGDR诱导的Cyp D敲除或抑制的T-HESC细胞毒性。最后当转染UTR缺失的Cyp D过表达载体后,同时mi R-1203的过表达并不能保护OGDR诱导的细胞损伤作用。结论:以上研究结果表明mi R-1203通过靶向并沉默Cyp D以保护人子宫内膜细胞免受OGDR的损伤,外源驱动mi R-1203-Cyp D级联可能是一种保护人子宫内膜细胞免受OGDR侵袭的新策略。
申道福[6]（2020）在《基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制》文中研究指明目的:通过体外实验,研究新藤黄酸（GNA）对顺铂耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549/Cis细胞周期、凋亡及顺铂耐药的影响。采用高通量测序（RNA-seq）方法研究GNA影响的A549/Cis细胞转录调控,分析差异基因表达及其功能,探讨GNA引起的A549/C is细胞生物学效应的重要线索,并加以验证。最后,通过在A549/C is细胞中分别过表达MTCYB和沉默TP53来研究二者在GNA介导的生长抑制中的作用,以阐明GNA影响A549/Cis细胞顺铂耐药的潜在调控靶点,为其在治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的临床应用提供理论依据。材料与方法:论文一:MTT法验证A549/Cis细胞对顺铂的耐药性。使用不同浓度的顺铂处理A549细胞和A549/Cis细胞,分别于24h、48h、72h后加入MTT（5mg/ml）20μl,37°C孵育4h后,弃上清并加入DMSO溶解甲瓒,然后测定OD值,记录实验结果。MTT法检测GNA对A549细胞、A549/C is细胞生长的抑制作用。Hoechst 33342染色和荧光显微观察检测GNA对A549/Cis细胞形态的影响。GNA分别处理A549/Cis 24h,48h后,用Hoechst 33342（10μg/ml）染色,37?C孵育20min,并通过荧光显微镜观察细胞形态变化。流式细胞术检测GNA对A549/Cis细胞周期分布和凋亡的影响。细胞洗涤并经-20?C预冷的70%酒精固定过夜,用核糖核酸酶（RNase）溶液消化后经碘化丙啶（PI）染色,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。根据Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒使用说明对细胞进行染色,并用流式细胞仪检测染色细胞的凋亡率,数据通过Flowjo7.6.1软件进行分析。论文二:GNA处理前后A549/Cis细胞转录组学研究。A549/Cis细胞经4μM GNA处理24 h后,用TRIzol法提取总RNA。RNA-seq通过Illumina X10测序平台进行测序。使用Stringtie来分析m RNA的表达水平。使用R package-Ballgown选择|log2 fold change|≥1且具有统计学意义（P<0.05）的差异表达的m RNA和基因。通过DAVID网站（http://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。实时荧光定量PCR验证差异基因表达。根据Gene JET RNA纯化试剂盒使用说明提取A549/C is细胞总RNA。使用First Strand c DNA合成试剂盒进行c DNA合成,然后使用SYBR?Select Master Mix Kit试剂盒和实时PCR仪进行q PCR。通过比较性2-ΔΔCT法进行定量分析。Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。根据核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒使用说明提取核蛋白。BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行显色。使用Image J version 1.52软件对蛋白表达水平进行定量分析。论文三:构建MTCYB基因过表达逆转录病毒载体MSCV-PGK-MTCYB-2a-zs Green,转染293T细胞。用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选zs Green表达阳性（绿色荧光）的细胞,并用激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。q RT-PCR实验对分选后细胞的MTCYB的m RNA表达进行检测。最后通过MTT法检测过表达MTC YB的细胞对GNA敏感性的变化。构建人TP53基因RNA干扰（RNAi）逆转录病毒载体MSCV-U6-p53sh RNA-EF1-BFP并转染293T细胞,用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选BFP表达阳性（蓝色荧光）的细胞,并通过激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。下一步通过Western blot法对分选后的细胞进行p53蛋白表达的测定,鉴定p53沉默效果。最后,采用MTT法检测p53干扰后细胞对GNA的敏感性的变化。结果:论文一1.GNA抑制A549、A549/Cis细胞生长,并诱导A549/C is细胞发生凋亡形态学变化。MTT实验结果显示A549/C is细胞对顺铂的耐药性明显高于亲本细胞（P<0.001）。GNA对A549和A549/C is细胞的抑制效应通过MTT实验被测定,与未处理组相比,GNA显着降低了A549和A549/C is细胞的存活率（P<0.001）。6μM浓度的GNA仅在24h后即能诱导大量的细胞死亡,因此在随后的实验中使用了2μM和4μM浓度的GNA。Hoechst 33342染色实验进一步证明了GNA对A549/C is细胞的抑制作用。与未处理的细胞相比,经GNA处理的A549/Cis细胞增殖受到抑制,并出现明显的形态学改变。此外,在GNA处理的细胞中可观察到核固缩现象。2.GNA诱导A549/Cis细胞周期G1期阻滞和凋亡。为了研究GNA抑制A549/Cis增殖的细胞进程,我们使用流式细胞仪检测了A549/C is的细胞周期和凋亡情况。结果表明,与未处理组相比,GN A处理A549/C is细胞24h和48h后,细胞周期明显被阻滞于G1期（P<0.05）。4μM GNA作用48h后,sub-G1期亚群细胞数明显高于未处理组（P<0.001）。细胞周期阻滞可以诱导细胞死亡,并可通过流式细胞仪进行检测。Annexin V-APC/7-AAD双染色实验结果显示,4μM GNA作用于A549/Cis细胞48h后,凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。论文二1.经GNA处理A549/Cis细胞差异基因表达和富集分析结果。为了探究GNA如何抑制A549/Cis细胞的生长和促进其死亡,我们使用对照细胞和经GNA处理的细胞进行了RN A-seq实验。数据分析表明,GNA的处理引发了全局基因表达的变化。我们以P<0.05且|log2 fold change|≥1为筛选条件对以上基因进行了进一步的筛选,满足以上条件的基因视为差异表达基因（DEGs）。与对照组细胞相比,在GNA处理的细胞中,有353个上调的DEGs和425个下调的DEGs。为了进一步研究DEGs的功能,我们进行了GO功能和KEGG信号通路富集分析。经鉴定,在GO富集分析中,蛋白结合（protein binding）、胞质溶胶（cytosol）、细胞周期（cell cycle）是显着富集的类型。KEGG信号通路富集分析中,有26条显着富集（P<0.05）的信号通路。将上述K EGG信号通路按差异显着性排序后,发现DEGs主要富集于内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白酶体（proteasome）、细胞周期（cell cycle）、Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、DNA复制（DNA replication）。其中细胞周期、DNA复制和p53信号通路与肿瘤增殖密切相关。2.q RT-PCR验证RNA-seq结果。为了验证RNA-seq结果,我们选取14个DEGs进行q RT-PCR分析。结果显示,与未处理组细胞相比,4μM GNA组细胞所有基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。在这些基因中,有4个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达上调,另外10个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达下调。共有10个基因[GADD45A、细胞周期蛋白D3（CCND3）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、CDC20、CDC25B、PCNA、PLK1、MCM2、MCM3和MCM 7]参与细胞周期调控,6个基因[GADD45A、CCND3、CCNB1、SERPIN E1、THBS1和TNFRSF10B]与p53信号通路相关,两个基因（CASPASE7和TNFRSF10B）与细胞凋亡相关。q RT-PCR的结果与RNA-seq分析结果一致。3.GNA处理的A549/Cis细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。为了进一步研究GNA诱导的细胞周期阻滞和凋亡的潜在作用机制,我们检测了与细胞周期检测点和凋亡相关的蛋白表达水平。结果表明,与未处理组相比,经GNA处理的A549/C is细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4和CDK6的蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,而p21、GADD45A、p53和核p53的蛋白表达显着上调（P<0.05）。此外,我们检测了GNA处理的细胞中凋亡调控蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,GNA能显着提高caspase3/7蛋白前体及其活性形式的表达水平（P<0.05）,其下游与DNA修复相关的凋亡标志性蛋白PARP在A549/Cis细胞中显着上调（P<0.05）,其裂解作用也明显增强（P<0.05）。论文三1.在A549/Cis细胞中过表达MTCYB融合基因后,其对GNA的敏感性未发生明显变化。本实验设计合成的MTCYB融合基因成功连接入双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和MTCYB过表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/Cis细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/Cis细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。流式细胞仪分选zs Green阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。q RT-PCR实验验证MTCYB的m RNA表达,与对照组和MSCV-PGK-Neo-2a-zs Green载体转染（A549/Cis-NC）组相比,A549/Cis-MTCYB组细胞MTCYB表达升高（P<0.05）。使用MTT法测定MTCYB基因过表达后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。GNA对三组细胞都有明显的抑制作用,但抑制作用无明显差异。2.在A549/Cis细胞中沉默p53后,细胞对GNA的敏感性降低。本实验设计合成的p53干扰片段成功连接入双酶切线性化的逆转录病毒表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和p53 sh RNA表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/C is细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/C is细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。随后流式细胞仪分选BFP阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。Western blot实验检测p53蛋白的表达,结果显示,与阴性对照组和MSCV-U6-EF1-BFP载体转染（A549/Cis-sh RNA-NC）组相比,A549/Cis-p53sh RNA1、2、3三组细胞p53蛋白水平均显着降低（P<0.05）,尤其A549/C is-p53sh RNA2组降低最显着（P<0.001）。MTT法测定p53沉默后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。与对照细胞和A549/Cis-sh RNA-NC细胞相比,A549/Cis-p53-sh RNA2细胞活力受到的抑制作用明显减弱（P<0.05）,对GNA敏感性降低。结论:1.GNA可通过介导细胞周期G1期阻滞并诱导细胞凋亡,从而抑制顺铂耐药非小细胞肺癌A549/Cis细胞的生长。2.转录组学研究表明GNA可显着下调A549/C is细胞中MTCYB基因的表达,且GNA通过调控p53/p21/cyclin D-CDK4/6介导A549/Cis细胞周期G1期阻滞,并通过激活caspase3/7诱导细胞凋亡。3.p53是GNA抑制A549/Cis细胞生长机制中的关键调控因子。
杨春华[7]（2019）在《双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究》文中研究指明第一部分构建双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒目的:构建双调控并荷载精子相关抗原9（sperm associated antigen 9,SPAG9）短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9并验证调控SPAG9蛋白表达的效果。方法:1.将包含DD3基因启动子和SPAG9基因shRNA的载体质粒p DD3-ZD55-SPAG9shRNA与骨架质粒p BHGE3（含有腺病毒右臂序列）通过Lipofectamine TM2000共转染至HEK-293细胞内,包装成溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9。2.琼脂糖电泳验证正确后大量扩增病毒,通过Cs Cl密度梯度离心法纯化,半数组织细胞感染剂量（Tissue culture infective dose,TCID50）法测定滴度。3.通过Western Blot检测DD3-ZD55-SPAG9对PC-3和DU145细胞SPAG9基因的沉默效果。结果:1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,经扩增纯化后,DD3-ZD55-SPAG9的病毒滴度为9.46×10^8 pfu/ml。2.Western Blot结果显示DD3-ZD55-SPAG9可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9蛋白的表达,与对照组相比,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9,并可以有效沉默PC-3和DU145细胞内SPAG9基因的表达第二部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛（Docetaxel,DTX）在体外对去势抵抗性前列腺癌的治疗效果。方法:1.结晶紫染色和CCK-8观察各组对前列腺癌PC-3和DU145与正常前列腺细胞WPMY-1细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组对PC-3和DU145细胞迁移侵袭能力的抑制。3.Hoechst-33258染色实验检测各组PC-3和DU145细胞的凋亡。4.Western Blot实验检测PC-3和DU145细胞内SPAG9,侵袭和凋亡相关蛋白的表达。结果:1.结晶紫染色结果:各病毒治疗组对PC-3和DU145细胞的细胞毒性呈时间和滴度依赖性,DTX对PC-3和DU145细胞呈浓度和时间依赖性,各组处理48小时后,高浓度的DTX（>4ng/ml）,高滴度的ZD55-SPAG9（MOI>20）会对WPMY-1细胞产生毒性作用,而DD3-ZD55-SPAG9在MOI>50时才会对WPMY-1细胞产生毒性作用,提示DD3-ZD55-SPAG9较对照病毒具有更高的安全性。2.CCK-8结果:随病毒和药物作用时间的延长,对前列腺癌细胞的增殖抑制效果均逐渐增强,且随病毒滴度和药物浓度的升高,对细胞的增殖抑制效果也逐渐增强。感染48小时后,联合组对前列腺癌细胞的增殖抑制效果明显高于各单一治疗组。各处理组48小时后WPMY-1细胞增殖较对照组无明显差异。3.划痕实验结果:24小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组的划痕愈合面积百分比均低于PBS组,且联合组划痕愈合面积明显低于单一治疗组。4.Transwell实验结果:48小时后,在PC-3和DU145细胞内,各治疗组穿透小室膜的细胞数均低于PBS组,联合组穿透细胞数明显低于单一治疗组。5.Hoechst-33258染色结果:48小时后,各治疗组的细胞凋亡率均高于PBS组,且联合组细胞凋亡率明显高于单一组。6.Western Blot实验结果显示:各治疗组内SPAG9蛋白表达均低于PBS组,侵袭相关蛋白E-cadherin的表达均高于PBS组,Vimentin和MMP-2的表达均低于PBS组,凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8的表达均高于PBS组。联合组内SPAG9,Vimentin,MMP-2的表达量明显低于单治疗组,同时E-cadherin、caspase-3和caspase-8的表达量明显高于单治疗组。结论DD3-ZD55-SPAG9可以在体外有效抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移侵袭能力,并可以有效诱导PC-3和DU145凋亡,效果略低于ZD55-SPAG9,但对WPMY-1细胞具有更高的安全性。对前列腺癌细胞侵袭能力的抑制作用,其机制之一可能是沉默SPAG9基因表达后,通过调控与上皮细胞间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关蛋白,上调E-cadherin,下调Vimentin,MMP-2的表达有关。对前列腺癌细胞凋亡诱导机制可能是通过促进caspase8与caspase3介导的内源性凋亡实现,联合使用多西他赛可起协同作用,增强DD3-ZD55-SPAG9的抗肿瘤效果。第三部分溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤目的:观察溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9联合多西他赛对裸鼠移植瘤的治疗效果。方法:1.建立前列腺癌PC-3细胞荷瘤鼠模型。监测不同处理组对移植瘤的生长的影响。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测各组肿瘤的生长状况。2.原位末端缺口标记法（Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL）法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。3.免疫组化和Western Blot检测各组移植瘤细胞中的侵袭相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达情况。结果:1.成功构建裸鼠移植瘤,各治疗组肿瘤生长速度均低于对照组,HE结果显示各治疗组内均存在肿瘤细胞凋亡坏死,联合组更为明显。2.TUNEL结果显示各治疗组内均存在明显的肿瘤细胞凋亡,联合治疗组较单一治疗组凋亡现象更为明显。3.免疫组化和Western Blot结果显示各治疗组内SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增多,联合组对上述蛋白的表达调控更为显着。结论:DD3-ZD55-SPAG9可以有效抑制裸鼠移植瘤的生长,并促进移植瘤细胞凋亡,抑制SPAG9、Vimentin和MMP-2蛋白表达,促进E-cadherin蛋白表达。但效果略低于ZD55-SPAG9。联合使用多西他赛后可以获得较单一治疗更高的移植瘤治疗效果。
李一权[8]（2019）在《Apoptin对肝癌HepG-2细胞的凋亡和自噬作用研究》文中研究说明研究背景:原发性肝癌是全世界第二大癌症死亡原因。美国癌症协会发表2018年癌症统计,统计显示,过去25年来美国总的癌症死亡率下降了25%,肝癌的死亡率却在上升。据统计,全球每年约有70万新发肝癌患者和60万患者死于肝癌,而中国每年超过30万人死于肝癌,占全球肝癌死亡人数的一半左右。肝癌恶性程度高,预后极差,目前手术切除仍是治疗肝癌的有效方法,但远期疗效仍欠佳,因此,寻找高效低毒的药物是治疗肝癌的有效手段之一。人们认为肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖失控和分化异常的结果,同时与肿瘤细胞凋亡失衡有关。然而,随着分子生物学的发展,凋亡并非是决定细胞死亡命运的唯一因素。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡。某些情况下,自噬抑制凋亡,但自噬本身也会诱发细胞死亡,或与凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情况下作为备份机制诱导细胞死亡。Apoptin是一种具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用的蛋白质。因该蛋白不依赖于p53蛋白介导,也不被Bcl-2的过表达所抑制,故被视为新型的抗肿瘤生物蛋白。但Apoptin的自噬激活作用及与细胞凋亡的相互作用尚未被精确地阐明。研究目的:利用本课题组在先前研究中已构建的以人5型腺病毒为载体表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-apoptin,分析研究apoptin介导的人原发性肝癌HepG-2细胞杀伤作用的主要途径和自噬激活的作用及其与细胞凋亡的相互作用关系,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:1.通过结晶紫染色、MTS检测以及建立荷瘤和转移瘤模型等实验方法,分析了apoptin对人原发性肝癌HepG-2细胞的杀伤和抑制作用。2.通过 Hoechst 染色、AnnexinV-FITC/PI 流式检测、qPCR 和 Western blot 检测、JC-1染色和TMRM染色等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的主要方式途径。3.通过LTR染色、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞时自噬对apoptin的细胞抑制作用的影响。4.利用凋亡抑制剂QVD和自噬抑制剂CQ,并通过对凋亡和自噬的多种染色、对线粒体的染色、Annexin V-FITC/PI流式检测、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞时凋亡和自噬之间的相互关系。5.利用活性氧抑制剂NAC,并通过活性氧检测、Annexin V-FITC/PI流式检测、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 ROS水平对原发性肝癌细胞凋亡和自噬的影响。研究结果:1.Apoptin具有对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外杀伤和抑制作用。2.Apoptin主要以内源性凋亡途径抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的生长。3.Apoptin在抑制HepG-2细胞生长的同时会影响细胞自噬的变化,且抑制自噬能够增加HepG-2细胞的死亡率。4.Apoptin作用的HepG-2细胞中,抑制凋亡可显着降低细胞的自噬水平,且整体抑制效果在12 h大于24 h,48 h效果最为明显;而抑制自噬能够提高apoptin诱导HepG2细胞产生的凋亡作用,24 h时效果最为明显。5.Apoptin在HepG-2细胞中会显着影响活性氧水平的变化,其与细胞凋亡和自噬关系密切,且活性氧水平越高受自噬和凋亡的影响越大;抑制活性氧可有效的降低apoptin对HepG-2细胞的凋亡作用,且凋亡作用越强,抑制效果越明显;apoptin 作用的HepG-2细胞中,抑制活性氧可显着降低细胞的自噬水平,且整体降低效果在12 h大于24 h,48 h效果最为显着。研究结论:Apoptin可显着抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的生长,主要以细胞凋亡方式引起HepG-2细胞死亡,同时引发细胞自噬。在整个过程中自噬所起到的作用以保护性作用为主,而在凋亡水平处在最高时,凋亡作用可能超过了自噬所起到的保护作用的阈值,导致自噬处在了最低水平。Apoptin可能在诱导HepG-2细胞凋亡的同时产生了线粒体自噬现象。HepG-2细胞自噬和凋亡均导致线粒体ROS水平的变化。因此,本研究认为ROS可作为通过线粒体将自噬和细胞凋亡联系起来的关键因素。创新点:1.确定了 apoptin对肝癌HepG2细胞产生的凋亡作用所通过的主要途径。2.明确了 apoptin在抑制肝癌HepG2细胞的进程中对细胞自噬产生的影响。3.分析了 apoptin诱导肝癌HepG2细胞凋亡时,自噬和凋亡作用之间的相互作用关系。4.确定了 ROS在apoptin诱导肝癌HepG2细胞死亡时,对细胞凋亡和自噬的作用。
方敬敬[9]（2019）在《重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+靶向治疗肿瘤的体外实验研究》文中研究指明近年来,肿瘤免疫疗法作为继手术治疗、放化疗及靶向治疗之后的又一重要治疗手段,取得了巨大成功,逐渐成为肿瘤标准治疗方法之一。而溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗成果显着,代表了一种新的癌症免疫疗法。目前常用的溶瘤病毒有痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等,本课题组所采用的痘苗病毒具有安全性高、基因组容量大、复制效率高、传播速度快、副作用较明确等特点。痘苗病毒TK基因的表达产物能够利用脱氧尿嘧啶核苷的类似物Brdu,使病毒核酸合成受阻,抑制痘苗病毒在细胞中的复制,进而筛选出TK基因缺失的痘苗病毒。CCL5基因和SSTR2基因具有强力抗肿瘤作用。CCL5是趋化性细胞因子CC亚家族成员,其在肿瘤的发生、发展和转归中发挥重要作用。SSTR2是一种生长抑素受体2型,其可抑制肿瘤增生、诱导肿瘤细胞凋亡,并参与免疫系统调控。本课题组在前期工作中已成功构建了重组人CCL5、SSTR2基因的痘病毒真核表达载体pSC65-CCL5-SSTR2-Luc及其对照组pSC65-Luc,并经同源重组获得重组溶瘤痘病毒,其中对照组rVV-Luc+已完成筛选工作,rVV-CCL5-SSTR2-Luc+已完成前10轮的筛选,本研究在此基础上继续研究,总共筛选了23轮,WB验证经rVV-CCL5-SSTR2-Luc+感染的肿瘤细胞可正确表达CCL5和SSTR2蛋白,证实已成功筛选纯化出可正确表达CCL5和SSTR2的重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+。对病毒蚀斑和毒力的关系分析证实了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+的TK基因缺失有助于痘病毒安全性的提高。应用CCK8实验对rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外对肿瘤细胞的杀伤活力进行了评估,结果证实rVV-CCL5-SSTR2-Luc+可抑制HCT116、HELA、HCCLM3细胞活性,其对肿瘤细胞的抑制作用随感染时间增加逐渐增强。通过对重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+发挥溶瘤作用的10个潜在效应靶点的研究,探讨了其发挥溶瘤效应的作用机制。结果表明在大部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒可能是通过激发促凋亡蛋白酶caspase-3和凋亡促进因子Bax的表达升高,促进肿瘤细胞凋亡。在部分肿瘤细胞中可应激性地激发自身抗凋亡因子survivin和Bcl2表达上调。在部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+可通过降低VEGFA蛋白表达来阻断肿瘤内皮血管的生成,进而发挥抑瘤作用。本研究为进一步开展rVV-CCL5-SSTR2-Luc+治疗肿瘤的体内研究和临床研究奠定了坚实的实验和理论基础。研究结果:1.成功筛选纯化出了可正确表达CCL5和SSTR2蛋白的重组痘病毒rVVCCL5-SSTR2-Luc+。2.对病毒蚀斑和重组痘病毒毒力的关系进行分析的结果表明rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对细胞的致病力与野生型痘病毒WR相比有所降低,证实了rVVCCL5-SSTR2-Luc+的TK基因缺失有助于痘病毒安全性的提高。对rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外治疗肿瘤的作用进行了评估,结果表明rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对大肠癌细胞株HCT116、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株HCCLM3的细胞活性具有抑制作用,并且rVV-CCL5-SSTR2-Luc+对细胞的抑制作用随感染时间的增加逐渐增强。3.探讨了rVV-CCL5-SSTR2-Luc+在体外发挥溶瘤效应的作用机制。结果表明在大部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒可能是通过激发促凋亡蛋白酶caspase-3和凋亡促进因子Bax的表达升高,促进肿瘤细胞凋亡。在部分肿瘤细胞中,溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+也可通过应激性地激发自身抗凋亡因子survivin和Bcl2的表达上调或通过降低VEGFA蛋白表达来阻断肿瘤血管生成,进而发挥抑瘤作用。
蒋家云[10]（2019）在《自噬促进肝癌射频消融术后复发的作用及其分子机制研究》文中研究表明研究背景肝细胞癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居恶性肿瘤的第六位,死亡率居第三位,严重威胁全世界人民的健康。大部分肝癌患者就诊时已属于中晚期阶段,能真正接受手术切除的比例不足20%。射频消融同手术切除、肝移植一样,已经被公认为肝癌的三大根治性治疗手段之一。近年来,射频消融因其具有微创、恢复快、费用低、安全、可靠、可重复操作、住院时间短等优势,在临床上得到了广泛应用。早期肝癌射频消融治疗的5年总体生存率与手术切除大体相当,但术后复发率较高,这也是影响其临床疗效和预后的重要因素。因此,研究自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制,对于减少肝癌射频消融术后复发,改善肝癌射频消融治疗的疗效,具有非常重要的临床意义。大量的研究表明,自噬在肿瘤的发生发展过程中扮演着双重角色。一方面,自噬可清除正常细胞内损伤或衰老的蛋白质和细胞器,抑制肿瘤发生。另一方面,自噬可增强肿瘤细胞对恶劣环境应激的耐受性,促进肿瘤存活。越来越多的研究表明,热应激可在肺癌、宫颈癌细胞中激活自噬,促进肿瘤存活。但热应激能否诱导肝癌细胞发生自噬,以及热应激诱导的自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制尚不清楚。本研究在明确肝癌射频消融治疗能诱导自噬发生的基础上,揭示自噬标记物LC3可作为评估RFA术后复发的独立危险因素。体外模拟肝癌射频消融过渡区微环境,证实了热应激能诱导肝癌细胞发生自噬。通过一系列的功能实验验证,阐明了热应激可通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路诱导肝癌细胞发生保护性自噬。抑制自噬,可促进肝癌细胞凋亡增加。研究方法（1）收集陆军军医大学西南医院肝胆外科接受手术切除的肝癌患者的组织样本130例。其中,单纯手术切除100例,射频消融术后复发再次手术切除30例。同时收集5例肝移植供体正常肝组织。取一部分组织冻存于-80℃冰箱中,用于提取组织总蛋白和RNA,另一部分组织标本用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片用于免疫组化染色分析。Western blot检测LC3在肝癌细胞和肝癌组织中的表达,免疫组化检测LC3在单纯手术切除和射频消融术后复发再次手术切除肝癌组织中的表达部位和表达强度。（2）采用恒温热水浴模型模拟肝癌RFA过渡区微环境,设置不同温度梯度（37、43、45、47℃）、不同处理时间（0、15、30、45、60min）和热应激后不同检测时间点（0、2、4、8、12、24h）提取细胞总蛋白质进行western blot检测,探索自噬标记物LC3-Ⅱ、p62的表达及动态变化规律,筛选出热水浴处理的最佳温度、处理时间和热应激后最佳检测时间点。肝癌细胞转染自噬双标腺病毒后再进行热应激处理,激光共聚焦显微镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目。透射电镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目。（3）应用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,western blot检测自噬标记物LC3-Ⅱ、p62蛋白表达水平的改变,激光共聚焦显微镜下观察自噬小体和自噬溶酶体的亚细胞定位及数目,明确热应激是诱导自噬的发生还是抑制自噬的降解,验证热应激诱导的自噬流是否通畅。（4）应用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,CCK-8检测细胞活力的改变,EdU检测细胞增殖活性的改变,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变,western blot检测自噬标记物LC3-II、p62及凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达水平的改变。siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5后,western blot检测Beclin-1、Atg5表达的改变,验证siRNA的干扰效率。siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5后联合热应激处理肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。（5）采用恒温热水浴模拟肝癌RFA过渡区微环境,热应激处理肝癌细胞,ATPlite试剂盒检测ATP浓度的改变,western blot检测AMPK/mTOR信号通路中p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP-1/4EBP-1的表达的改变。应用AMPK激活剂AICAR和抑制剂compound C处理肝癌细胞后,western blot检测p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、LC3-II、p62表达的改变。（6）热应激处理肝癌细胞,将处理后的肝癌细胞种植到裸鼠右上肢近腋窝处皮下。将裸鼠随机分成4组:PBS组,CQ组,热应激组和氯喹联合热应激组,每组6只。对照组腹腔注射100μl PBS,实验组按60mg/kg的剂量腹腔注射氯喹PBS溶液100μl,每周3次。每3天记录肿瘤的体积和质量,直到第30天处死裸鼠。解剖并取下皮下肿瘤,记录肿瘤的体积和质量,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片用于H&E染色确认肿瘤组织,免疫组化检测LC3、p62、Ki-67、cleaved Caspase-3的亚细胞定位及表达水平。（7）统计学分析方法:所有研究结果均用均数±标准误表示。采用SPSS18.0软件对数据结果进行统计分析和作图。对于呈正态分布的计量资料,两个组之间的差异比较选用Student’s t检验,而多个组之间的差异比较选择单因素方差分析。对于计数资料,选择卡方检验或Fisher确切概率法进行分析。当P<0.05时,认为差异有统计学意义。研究结果（1）LC3在肝癌细胞株中表达水平明显高于正常肝细胞L02,LC3在肝癌组织中呈现明显高表达的特点,过表达率为77.3%（17/22）。免疫组化显示LC3在射频消融术后复发再切除肝癌组织中表达明显高于单纯手术切除的肝癌组织,而p62在射频消融术后复发再切除肝癌组织中表达明显低于单纯手术切除的肝癌组织,且主要位于细胞浆。临床病理参数的相关性分析表明LC3高表达与术后复发密切相关（P<0.05）,而与年龄、性别、HBV感染、Child-Pugh肝功能分级、肝硬化情况、血清AFP水平、肿瘤数目、肿瘤大小、血管侵犯、淋巴结侵犯、肿瘤的分化程度等病理参数无明显相关性。Kaplan-Meier’s分析表明LC3过表达患者较LC3低表达患者5年总体生存期较短,RFA术后复发率较高（P<0.05）。以上结果说明,自噬标记物LC3可作为预测肝癌射频消融术后复发和预后的分子标记物。（2）肝癌细胞SMMC7721和Huh7接受不同温度（37、43、45、47℃）热应激处理1h。随着温度不断升高,LC3-Ⅱ表达增加,而p62表达逐渐减少,说明不同温度的热应激可诱导肝癌细胞发生自噬,且呈现温度依赖性的特点。肝癌细胞SMMC7721和Huh7接受47℃热应激处理不同时间（0、15、30、45、60min）。随着处理时间延长,LC3-Ⅱ表达不断增加,而p62表达逐渐减少,说明热应激处理不同时间均可诱导自噬的发生,且呈现出时间依赖性的特点。肝癌细胞SMMC7721和Huh7转染自噬双标腺病毒HBAD-mRFP-GFP-LC3B后再进行不同温度的热应激处理。激光共聚焦结果显示,绿色斑点的自噬小体和黄色斑点的自噬溶酶体大多位于细胞核周围的细胞浆中,绿色斑点（GFP-LC3）和黄色斑点（mRFP-GFP-LC3）数目均随着温度升高而增加,直观地说明热应激能诱导肝癌细胞发生自噬,呈现温度依赖性的特点。光学显微镜结果表明,热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7后出现大量囊状空泡样结构。透射电镜结果证实,热应激处理的肝癌细胞SMMC7721和Huh7中大量增加的囊状空泡样结构为双层膜包裹的自噬小体或自噬溶酶体,平均数目从3增加到20以上（P<0.001）。以上结果表明,亚致死性热应激可诱导肝癌细胞发生自噬,且具有一定的温度依赖性和时间依赖性。47℃热应激处理30min,肝癌细胞SMMC7721和Huh7后,LC3-Ⅱ增加和p62减少均非常显着,且细胞仍保持一定的活力。因此,我们选择47℃热应激处理30min模拟肝癌射频消融过渡区微环境的条件用于开展后续的实验。（3）47℃热应激处理肝癌细胞时间从30min增加至60min时,肝癌细胞SMMC7721和Huh7中LC3-Ⅱ表达进一步增加,而p62表达进一步减少（P<0.001）。47℃热应激30min联合氯喹处理组和47℃热应激30min处理组比较,肝癌细胞SMMC7721和Huh7中LC3-Ⅱ表达进一步增加,而p62表达也进一步增加（P<0.001）。肝癌细胞SMMC7721和Huh7转染自噬双标腺病毒HBAD-mRFP-GFP-LC3B后再进行热应激和氯喹处理,激光共聚焦显微镜下观察并统计分析发现,合并后的荧光图像显示绿色斑点（自噬小体）明显增加,而黄色斑点（自噬溶酶体）增加较少。以上结果表明,亚致死性热应激诱导肝癌细胞内LC3-Ⅱ的蓄积是由于热应激诱导自噬发生引起,而不是抑制自噬的降解过程所致。热应激诱导肝癌细胞发生自噬过程中自噬流是畅通的。（4）氯喹联合热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7,CCK-8检测细胞活力结果表明,47℃热应激处理30min可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的活力明显下降,而应用氯喹联合热应激处理,肝癌细胞SMMC7721和Huh7的活力进一步下降,且SMMC7721细胞的活力下降更为明显,差异具有显着统计学差异（P<0.001）。EdU检测细胞的增殖活性结果表明,47℃热应激处理30min可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的增殖活性明显降低,细胞在热应激后增殖几乎停滞。氯喹联合热应激处理,肝癌细胞SMMC7721和Huh7的增殖活性没有进一步地降低。结果表明,氯喹可抑制热应激诱导的自噬,但对细胞增殖活性无明显的影响。流式细胞检测结果表明,47℃热应激处理30min可诱导肝癌SMMC7721和Huh7凋亡增加,用氯喹联合热应激处理肝癌细胞,可使肝癌细胞SMMC7721和Huh7的凋亡率进一步显着增加（P<0.001）。Western blot检测结果表明,47℃热应激处理30min可诱导肝癌SMMC7721和Huh7自噬标记物LC3-II表达增加,p62表达减少,促进凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达明显增加。氯喹联合热应激处理肝癌细胞SMMC7721和Huh7,自噬标记物LC3-II表达进一步增加,p62表达也增加,而凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、cleaved RAPR表达进一步显着增加。此外,用siRNA干扰实验结果表明,siRNA抑制自噬后,热应激诱导的细胞凋亡率明显增加。以上结果均表明,用氯喹或siRNA干扰Beclin-1、Atg5的表达可抑制热应激诱导肝癌细胞发生的自噬,可使热应激抑制的细胞活力明显降低,主要是通过抑制自噬促进热应激诱导的细胞凋亡增加引起,而对热应激抑制的细胞增殖活性无明显影响。（5）47℃热应激处理肝癌细胞30min,ATPlite检测肝癌细胞SMMC7721和Huh7内ATP浓度时发现,热应激处理使肝癌细胞SMMC7721和Huh7内ATP浓度显着降低,差异具有显着统计学意义（P<0.001）。Western blot检测AMPK/mTOR信号通路中相关蛋白表达表明,p-AMPK表达明显增加,p-mTOR表达明显减少。检测mTOR信号通路下游两个关键蛋白p-P70S6K和p-4E-BP1发现,p-P70S6K表达明显减少,p-4E-BP1表达明显也减少。应用AMPK激活剂阿卡地新AICAR处理肝癌细胞作为阳性对照,western blot结果表明,热应激同AMPK激活剂阿卡地新AICAR一样,促进肝癌细胞SMMC7721和Huh7内p-AMPK表达明显增加,p-mTOR表达明显减少,同时促进自噬标记物LC3-Ⅱ表达增加,p62表达减少。而应用AMPK抑制剂compound C联合热应激处理肝癌细胞后,western blot结果表明p-AMPK表达减少,p-mTOR表达增加,自噬标记物LC3-II表达减少,p62表达增加。以上结果表明,热应激诱导肝癌细胞发生自噬是通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路发挥作用的。（6）裸鼠皮下成瘤实验表明,单纯氯喹处理组和PBS组比较,皮下肿瘤的体积和质量无明显差异。热应激处理组与PBS组比较,皮下肿瘤的生长受到了中等程度的抑制,肿瘤的体积和质量明显减少（P<0.001）。与热应激处理组比较,氯喹联合热应激处理组肿瘤的生长受到了明显的抑制,肿瘤的体积和质量进一步明显减少（P<0.001）。取皮下肿瘤组织,经过脱水、固定和石蜡包埋后进行免疫组织化学分析,H&E染色结果表明,肿瘤的异型性明显,核分裂相增多,核质比明显增加,细胞排列紊乱,呈现典型的肝细胞癌的病理学特点。免疫组化结果表明,热应激处理组LC3表达明显增加,p62表达明显减少,主要分布于细胞浆,说明热应激后肿瘤体内也能激活自噬和自噬流。热应激处理组Ki-67表达明显减少,而cleaved Caspase-3表达明显增加,说明热应激可明显抑制肿瘤的增殖活性,促进肿瘤凋亡明显增加。氯喹联合热应激处理肝癌与单纯热应激处理组比较,LC3表达明显增加,而p62表达也增加,Ki-67表达减少,cleaved Caspase-3表达明显增加（P<0.001）,说明氯喹可在体内抑制热应激诱导的自噬,促进肿瘤凋亡增加。以上结果表明,氯喹可通过抑制自噬的降解过程抑制热应激诱导的自噬,促进肿瘤细胞凋亡明显增加,可在体内增强射频消融等热疗的抗肿瘤效应。研究结论综上所述,自噬标记物LC3在肝癌细胞和肝癌组织中高表达,尤其是射频消融术后复发的肝癌组织中的表达更高。LC3高表达与肝癌射频消融术后复发率呈明显正相关,表明LC3可作为判断肝癌射频消融术后复发和预后的分子靶标。此外,体外模拟肝癌射频性消融过渡区微环境发现,不同温度热应激处理不同时间均可诱导肝癌细胞发生自噬,且具有一定的温度和时间依赖性。氯喹联合热应激处理肝癌细胞证实热应激诱导的肝癌细胞内LC3-Ⅱ的蓄积是由热应激诱导自噬的发生引起,而不是抑制自噬的降解所致。热应激诱导肝癌细胞发生自噬过程中自噬流是畅通的。功能实验研究表明,热应激诱导肝癌细胞发生的自噬对肝癌细胞是保护性的,氯喹或siRNA干扰自噬相关基因Beclin-1、Atg5可抑制热应激诱导的自噬,促进热应激诱导的肝癌细胞凋亡明显增加。体内实验证实,氯喹联合热应激处理肝癌细胞,可抑制热应激诱导的自噬,明显抑制皮下肿瘤的生长,使皮下肿瘤的体积和质量明显减少,促进肿瘤细胞凋亡增加,增强肿瘤热疗的抗肿瘤效应。进一步的分子机制研究表明,热应激诱导肝癌细胞发生自噬主要是通过激活ATP-AMPK-mTOR信号通路发挥作用的。通过该研究,阐明了自噬在肝癌射频消融术后复发中的作用及其分子机制,为减少肝癌RFA术后复发,改善肝癌RFA治疗疗效提供了新的思路和治疗策略。
二、腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究（论文提纲范文）
（1）共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 重组腺病毒在肝癌治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的研究背景 |
| 1.1.2 腺病毒载体的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 腺病毒载体的研究现状 |
| 1.1.2.2 腺病毒载体在肿瘤治疗中的进展 |
| 1.2 肿瘤靶向肽与细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽的抑瘤机制 |
| 1.3.2 蜂毒肽的研究进展 |
| 1.4 凋亡素的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.4.1 凋亡素的抑瘤机制 |
| 1.4.2 凋亡素的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 技术路线 |
| 1.5.2 研究内容及意义 |
| 第二章 共表达GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 重组质粒pMD-TAT-Apoptin和 pMD-UBI-RGD-MEL提取 |
| 2.1.2.3 高保真扩增目的基因TAT-Apoptin和 UBI-RGD-MEL |
| 2.1.2.4 PCR产物胶回收 |
| 2.1.2.5 重组腺病毒载体构建 |
| 2.1.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因特异性扩增 |
| 2.2.2 GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.2.3 GV-TAT-Apoptin重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 GV-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 共表达Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 溶液和培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 重组腺病毒穿梭质粒与大骨架质粒提取 |
| 3.1.2.3 共转染HEK293A细胞 |
| 3.1.2.4 重组腺病毒扩增与纯化 |
| 3.1.2.5 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.1.2.6 RT-PCR检测目的基因的表达 |
| 3.1.2.7 间接免疫荧光检测目的基因表达 |
| 3.1.2.8 Western blotting检测目的蛋白表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 各重组腺病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 RT-PCR检测目的基因转录情况 |
| 3.2.3 各重组腺病毒感染SMMC-7721 肝癌细胞情况 |
| 3.2.4 Western blotting检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达情况 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒体外抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 重组腺病毒和细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 CCK-8 法检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞、Huh7 细胞、L-02 细胞的杀伤作用 |
| 4.1.2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.4 细胞划痕试验检测SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.5 细胞趋化试验检测FBS介导的SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.6 细胞侵袭试验检测SMMC-7721 细胞侵袭能力 |
| 4.1.2.7 ROS检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞活性氧含量影响 |
| 4.1.2.8 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.9 扫描电镜观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 各重组腺病毒抑制L-02 细胞增殖 |
| 4.2.2 各重组腺病毒抑制SMMC-7721 细胞增殖 |
| 4.2.3 各重组腺病毒抑制Huh7 细胞增殖 |
| 4.2.4 各重组腺病毒SMMC-7721 细胞凋亡蛋白表达 |
| 4.2.5 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡结果 |
| 4.2.6 细胞划痕试验结果 |
| 4.2.7 细胞趋化试验结果 |
| 4.2.8 细胞侵袭试验结果 |
| 4.2.9 ROS含量检测结果 |
| 4.2.10 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡 |
| 4.2.11 扫描电镜观察各重组腺病毒诱导SMMC-7721 细胞形态变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒体内抑瘤作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 SMMC-7721 实体瘤模型的建立与荷瘤裸鼠治疗 |
| 5.1.2.2 病理切片制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL染色 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠体重变化曲线 |
| 5.2.2 各重组腺病毒对荷瘤裸鼠内脏器官及肿瘤重量影响 |
| 5.2.3 裸鼠各组织HE染色结果 |
| 5.2.4 肿瘤组织免疫组织化学结果 |
| 5.2.5 TUNEL染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文及着作 |
（2）基于质粒的Akt1特异性siRNA和P53共表达协同抑制肝细胞癌细胞的增值、迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述 P53和PI3K/Akt通路在肝细胞癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（3）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肺癌抑制基因 |
| 1.2 ING4及IL-24基因的抑癌作用 |
| 1.2.1 ING4基因 |
| 1.2.2 IL-24基因 |
| 1.2.3 ING4及IL-24双基因协同作用 |
| 1.3 ING4及IL-24基因的传递载体 |
| 1.4 腺病毒载体 |
| 1.4.1 腺病毒性质 |
| 1.4.2 腺病毒载体的修饰 |
| 1.5 柞蚕丝素蛋白 |
| 1.5.1 柞蚕丝素蛋白的性质 |
| 1.5.2 柞蚕丝素蛋白应用于基因传递载体 |
| 1.5.3 柞蚕丝素蛋白的阳离子化修饰 |
| 1.6 肺癌细胞的靶向配体 |
| 1.6.1 靶向分子 |
| 1.6.2 靶向肽 |
| 1.7 本文的研究目的及内容 |
| 第二章 ING4-IL-24双基因共表达腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液、卡那板及凝胶的配制 |
| 2.2.2 双基因重组转移质粒的扩增 |
| 2.2.3 双基因重组转移质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.4 同源重组腺病毒质粒的构建 |
| 2.2.5 双基因共表达同源重组腺病毒的包装和扩增 |
| 2.2.6 双基因共表达腺病毒的效价 |
| 2.2.7 双基因共表达腺病毒中ING4基因的表达 |
| 2.2.8 双基因共表达腺病毒中IL-24基因的表达 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双基因共表达质粒的鉴定 |
| 2.3.2 同源重组腺病毒的构建和鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒的包装和扩增 |
| 2.3.4 鉴定同源重组腺病毒中双基因的表达 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 柞蚕生丝脱胶 |
| 3.2.3 柞蚕丝素溶解 |
| 3.2.4 柞蚕溶液浓度测定 |
| 3.2.5 PEI改性柞蚕丝素蛋白 |
| 3.2.6 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.2.7 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.2.8 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.2.9 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.2.10 Cu~(2+)滴定法测定PEI接枝效率 |
| 3.2.11 CASF溶液粘度 |
| 3.2.12 CASF的圆二色光谱 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PEI改性柞蚕丝素蛋白的反应过程 |
| 3.3.2 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.3.3 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.3.4 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.3.5 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.3.6 PEI接枝柞蚕丝素蛋白的效率 |
| 3.3.7 CASF溶液粘度 |
| 3.3.8 CASF的二级结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阳离子化柞蚕丝素蛋白的肺癌靶向肽修饰 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 柞蚕丝脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 4.2.2 靶向肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.2.3 CASF-C_9的表面Zeta电位测定 |
| 4.2.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱测试 |
| 4.2.5 CASF-C_9的X-射线光电子能谱测试 |
| 4.2.6 CASF-C_9的红外吸收光谱测试 |
| 4.2.7 CASF-C_9的能谱测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 寡肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.3.2 CASF-C_9的表面Zeta电位 |
| 4.3.3 CASF-C_9的能量色散X-射线光谱 |
| 4.3.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱 |
| 4.3.5 CASF-C_9的红外吸收光谱 |
| 4.3.6 CASF-C_9的X-射线光电子能谱 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 CASF-C_9/pDNA复合物对肺癌细胞的靶向生物学效应 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 琼脂糖凝胶的配制 |
| 5.2.2 质粒的摇菌、抽提及浓度测定 |
| 5.2.3 CASF-C_9/pDNA复合物的制备 |
| 5.2.4 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.2.5 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.2.6 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.2.7 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的绿色荧光表达 |
| 5.2.8 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.2.9 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的存活率 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.2 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.3.3 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.3.4 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的荧光表达 |
| 5.3.5 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.3.6 CASF-C_9/pDNA复合物对细胞增殖的影响 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 CASF-C_9/Ad复合物的制备及其体外生物学效应 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 6.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 6.2.3 材料与腺病毒的荧光标记 |
| 6.2.4 不同感染复数的腺病毒体外感染细胞 |
| 6.2.5 CASF-C_9/Ad复合物的制备 |
| 6.2.6 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.2.7 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.2.8 CASF-C_9/Ad复合物的靶向作用 |
| 6.2.9 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.2.10 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.2.11 CASF-C_9/Ad复合物中ING4基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.12 CASF-C_9/Ad复合物中IL-24基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.13 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞后的存活率 |
| 6.2.14 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞凋亡 |
| 6.2.15 数据统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 不同感染复数的裸腺病毒体外感染细胞 |
| 6.3.2 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.3.3 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.3.4 CASF-C_9/Ad复合物与细胞共作用 |
| 6.3.5 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.3.6 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.3.7 CASF-C_9/Ad复合物对细胞增殖的影响 |
| 6.3.8 CASF-C_9/Ad复合物中外源性双基因在H460细胞中的表达 |
| 6.3.9 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞H460凋亡 |
| 6.3.10 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 CASF-C_9/Ad复合物抑制肺癌移植瘤生长的动物实验 |
| 7.1 实验材料与仪器 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 7.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 7.2.3 CASF-C9/Ad复合物的制备 |
| 7.2.4 荷瘤小鼠致瘤所需H460细胞数量试验 |
| 7.2.5 建立小鼠H460肺癌移植瘤 |
| 7.2.6 CASF-C9/Ad复合物治疗肺癌移植瘤 |
| 7.2.7 免疫组化检测 |
| 7.2.8 数据统计分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小鼠移植瘤的致瘤细胞数量 |
| 7.3.2 CASF-C9/Ad复合物的抑瘤作用 |
| 7.3.3 HE染色观察肿瘤组织 |
| 7.3.4 免疫组化检测肿瘤相关因子的表达 |
| 7.3.5 讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结语 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 本论文的主要创新点 |
| 8.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间本人发表的论文及着作 |
| 致谢 |
（5）miR-1203沉默亲环蛋白D拮抗子宫内膜细胞氧糖剥夺再加氧损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-1203 靶向CypD并调控其表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| (一)材料 |
| (二)实验方法 |
| 结果 |
| 1.生信预测miR-1203与CypD的靶向关系 |
| 2.在T-HESC细胞系中pre-miR-1203 过表达靶向并降低CypD表达 |
| 3.miR-1203 模拟物降低CypD表达 |
| 4.在原代人子宫内膜细胞中miR-1203 过表达降低CypD表达 |
| 5.miR-1203 表达抑制可提高人子宫内膜细胞CypD的表达 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-1203对OGDR诱导的子宫内膜细胞程序性坏死的保护作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 结果 |
| 1.过表达miR-1203 显着抑制OGDR诱导的ROS生成 |
| 2.过表达miR-1203 显着抑制OGDR诱导子宫内膜细胞线粒体去极化 |
| 3.外源性过表达miR-1203 显着抑制OGDR诱导的胞浆细胞色素C释放 |
| 4.外源性过表达miR-1203 显着抑制OGDR诱导子宫内膜细胞活力降低和坏死 |
| 5.OGDR诱导不影响子宫内膜细胞miR-1203和CypD表达 |
| 6.外源性过表达miR-1203 显着抑制OGDR诱导的人原代子宫内膜细胞ROS产生 |
| 7.外源性过表达miR-1203 显着抑制了OGDR诱导的原代人子宫内膜线粒体去极化和胞浆细胞色素C释放 |
| 8.原代子宫内膜细胞中外源性过表达miR-1203 抑制OGDR诱导的细胞坏死 |
| 9.T-HESC人子宫内膜细胞系中抑制miR-1203 增加OGDR诱导的ROS释放 |
| 10.T-HESC人子宫内膜细胞系中抑制miR-1203 增加OGDR诱导线粒体去极化和胞浆细胞色素C释放 |
| 11.miR-1203 的抑制增强了OGDR诱导的子宫内膜细胞毒性 |
| 12.原代子宫内膜细胞中抑制miR-1203 表达促进OGDR诱导的ROS生成 |
| 13.原代子宫内膜细胞中抑制miR-1203 表达促进OGDR诱导线粒体去极化和胞浆细胞色素C释放 |
| 14.原代子宫内膜细胞中抑制miR-1203 表达增强了OGDR诱导细胞毒性 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-1203 通过抑制Cyp D保护人子宫内膜细胞免受OGDR诱导的损伤 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 结果 |
| 1.CypD-KOT-HESC细胞免受OGDR诱导的细胞毒性作用 |
| 2.UTR缺失的CypD过表达质粒完全恢复lv-miR-1203 过表达的T-HESC子宫内膜细胞Cyp D m RNA和蛋白表达 |
| 3.当 UTR缺失的CypD表达恢复时,miR-1203 的外源性高表达不能保护T-HESC细胞免受OGDR的损伤 |
| 4.当CypD被 CsA阻断时,miR-1203 不能保护OGDR诱导的人原代子宫内膜细胞死亡 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向治疗子宫内膜缺血再灌注程序性坏死损伤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论着、论文 |
| 中英文缩略词 |
| 致谢 |
（6）基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 新藤黄酸诱导 A549/Cis 细胞周期阻滞及凋亡,影响 NSCLC 顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于RNA-seq 技术的新藤黄酸干预下 A549/Cis 细胞转录组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 新藤黄酸影响 A549/Cis 细胞顺铂耐药调控靶点的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 新藤黄酸抗肿瘤作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌化疗中顺铂耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建双调控并荷载SPAG9 基因shRNA的溶瘤腺病毒 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、质粒、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.成功构建溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 |
| 2.DD3-ZD55-SPAG9 的扩增、纯化与滴度测定 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 抑制前列腺癌细胞内SPAG9 蛋白表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛体外治疗去势抵抗性前列腺癌 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞、培养基 |
| 1.2 主要试剂、材料 |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂的配制 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.结晶紫染色检测DD3-ZD55-SPAG9+DTX对细胞的毒性作用 |
| 2.溶瘤腺病毒ZD55-SPAG9 及多西他赛抑制前列腺癌细胞的生长 |
| 3.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞迁移能力 |
| 4.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制前列腺癌细胞侵袭能力 |
| 5.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX促进前列腺癌细胞凋亡 |
| 6.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX下调SPAG9、Vimentin、MMP-2 蛋白,上调E-cadherin、caspase-8、casepase-3 蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SPAG9 联合多西他赛治疗裸鼠移植瘤 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1.DD3-ZD55-SPAG9 联合DTX抑制裸鼠移植瘤生长 |
| 2. HE 染色 |
| 3.TUNEL凋亡试剂盒检测肿瘤凋亡 |
| 4.免疫组化法检测肿瘤组织中SPAG9 蛋白与EMT相关蛋白 |
| 5.Western Blot检测肿瘤组织内SPAG9和EMT相关蛋白表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 研究创新 |
| 存在的问题和改进方法 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 溶瘤腺病毒介导的抗肿瘤治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 嵌合抗原受体 T 细胞免疫治疗前列腺癌现状及进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 Abbreviation |
| 攻读学位期间参与发表的学术成果 |
| 致谢 |
（8）Apoptin对肝癌HepG-2细胞的凋亡和自噬作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 凋亡素研究进展 |
| 1.1.1 凋亡素简介 |
| 1.1.2 凋亡素序列与结构 |
| 1.1.3 凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究 |
| 1.1.4 凋亡素介导的细胞死亡机制 |
| 1.1.5 凋亡素相互作用分子 |
| 1.1.6 凋亡素的核转移-对其凋亡作用至关重要 |
| 1.1.7 凋亡素磷酸化-在诱导凋亡中的作用 |
| 1.1.8 凋亡素的临床前景 |
| 1.2 基于AD载体的肿瘤治疗 |
| 1.3 自噬与凋亡的结合 |
| 1.3.1 自噬简介 |
| 1.3.2 自噬过程 |
| 1.3.3 ROS平衡 |
| 1.3.4 作为信号分子的ROS |
| 1.3.5 作为信号分子的RNS |
| 1.3.6 ROS对自噬的直接影响 |
| 1.3.7 自噬与凋亡的关系 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、毒株、菌株、质粒以及实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备细胞 |
| 2.2.2 传代细胞 |
| 2.2.3 接种病毒 |
| 2.2.4 重组腺病毒的纯化 |
| 2.2.5 测定病毒毒价 |
| 2.2.6 结晶紫染色检测 |
| 2.2.7 MTS检测 |
| 2.2.8 体内抑制肿瘤实验 |
| 2.2.9 Hoechst染色 |
| 2.2.10 Annexin V-FITC/PI检测 |
| 2.2.11 JC-1染色 |
| 2.2.12 细胞总RNA提取 |
| 2.2.13 引物设计和鉴定 |
| 2.2.14 荧光定量PCR检测 |
| 2.2.15 Western Blot检测 |
| 2.2.16 溶酶体染色观察 |
| 2.2.17 TMRM染色 |
| 2.2.18 线粒体及溶酶体共染观察 |
| 2.2.19 线粒体凋亡和自噬染色观察 |
| 2.2.20 ROS检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一部分 Apoptin对肝癌细胞的抑制作用研究 |
| 3.1.1 光镜观察结果 |
| 3.1.2 结晶紫染色结果 |
| 3.1.3 MTS检测结果 |
| 3.1.4 Apoptin的体内肿瘤抑制作用结果 |
| 第二部分 Apoptin引起细胞抑制作用的主要途径及细胞自噬对细胞抑制作用影响研究 |
| 3.2.1 Hoechst染色结果 |
| 3.2.2 Annexin V检测结果 |
| 3.2.3 荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达水平 |
| 3.2.4 PARP和Caspase-3的蛋白质水平 |
| 3.2.5 JC-1染色结果 |
| 3.2.6 TMRM染色结果 |
| 3.2.7 细胞凋亡对apoptin抑制HepG-2细胞的影响 |
| 3.2.8 LTR染色结果 |
| 3.2.9 荧光定量PCR检测自噬相关基因的表达水平 |
| 3.2.10 LC3、P62和Beclin-1的蛋白质水平 |
| 3.2.11 细胞自噬对apoptin抑制HepG-2细胞的影响 |
| 第三部分 Apoptin诱导肝癌细胞自噬与凋亡关系研究 |
| 3.3.1 抑制凋亡后细胞自噬的变化 |
| 3.3.2 抑制凋亡后LC3、P62和Beclin-1的mRNA水平 |
| 3.3.3 抑制凋亡后LC3、P62和Beclin-1的蛋白质水平 |
| 3.3.4 抑制自噬后细胞凋亡的变化 |
| 3.3.5 抑制自噬后PARP和Caspase-3的mRNA水平 |
| 3.3.6 PARP和Caspase-3的蛋白质水平 |
| 3.3.7 TMRM染色结果 |
| 3.3.8 MTG和LTR染色结果 |
| 3.3.9 TMRM和LC3染色结果 |
| 第四部分 Apoptin作用肝癌细胞后活性氧对细胞凋亡和自噬的关系研究 |
| 3.4.1 apoptin对活性氧的抑制作用 |
| 3.4.2 ROS对apoptin抑制HepG-2细胞的影响 |
| 3.4.3 抑制活性氧后凋亡水平的变化 |
| 3.4.4 抑制活性氧后PARP和Caspase-3的mRNA水平 |
| 3.4.5 抑制活性氧后PARP和Caspase-3的蛋白质水平 |
| 3.4.6 抑制活性氧后细胞自噬的变化 |
| 3.4.7 抑制活性氧后LC3、P62和Beclin-1的mRNA水平 |
| 3.4.8 抑制凋亡后LC3、P62和Beclin-1的蛋白质水平 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+靶向治疗肿瘤的体外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症概况 |
| 1.2 癌症的治疗 |
| 1.3 溶瘤病毒概况 |
| 1.4 CCL5 基因与SSTR2 基因 |
| 1.5 本课题的选题依据、研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+的筛选、纯化、滴度测定和表达验证 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 细胞、质粒和病毒 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器与耗材 |
| 2.3.4 主要试剂的配制 |
| 2.3.5 引物信息 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 pSC65-CCL5-SSTR2-Luc+/pSC65-Luc+转染经痘病毒感染的细胞(同源重组) |
| 2.4.3 痘病毒阳性重组子的筛选纯化 |
| 2.4.4 WR株痘病毒贮液和重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+及其对照rVV-Luc+贮液的扩大培养 |
| 2.4.5 痘病毒的浓缩纯化 |
| 2.4.6 痘病毒的滴度(PFU/ml)测定(结晶紫染色法) |
| 2.4.7 重组痘病毒阳性重组子的表达验证 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+的筛选、扩大培养和浓缩纯化 |
| 2.5.2 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+贮液的滴度测定 |
| 2.5.3 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+的表达验证 |
| 2.6 讨论和小结 |
| 第三章 重组痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+治疗肿瘤的作用和机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验主要试剂 |
| 3.3.2 实验主要仪器与耗材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1病毒蚀斑形成实验 |
| 3.4.2 CCK-8 实验 |
| 3.4.3 WB实验 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+发挥溶瘤效应的作用研究 |
| 3.5.2 重组溶瘤痘病毒r VV-CCL5-SSTR2-Luc+发挥溶瘤效应的机制研究 |
| 3.6 小结 |
| 3.7 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 A攻读学位期间发表论文、申请专利和参与科研项目情况 |
| 附件 |
| 致谢 |
（10）自噬促进肝癌射频消融术后复发的作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 自噬标记物LC3在单纯肝切除和射频消融术后复发再切除肝癌组织中的表达及其临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 自噬促进肝癌射频消融术后复发的作用及其分子机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肝癌射频消融治疗的最新研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬在肿瘤发生发展中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文、获得的奖励 |
| 致谢 |
四、腺病毒介导的p53抑制肝癌生长的实验研究（论文参考文献）
- [1]共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究[D]. 武静桥. 天津农学院, 2021(08)
- [2]基于质粒的Akt1特异性siRNA和P53共表达协同抑制肝细胞癌细胞的增值、迁移和侵袭[D]. 陈小龙. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [4]肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物[D]. 瞿静. 苏州大学, 2020(06)
- [5]miR-1203沉默亲环蛋白D拮抗子宫内膜细胞氧糖剥夺再加氧损伤的实验研究[D]. 胥红斌. 苏州大学, 2020(06)
- [6]基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制[D]. 申道福. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [7]双调控并荷载SPAG9基因shRNA的溶瘤腺病毒联合多西他赛治疗前列腺癌的实验研究[D]. 杨春华. 苏州大学, 2019(06)
- [8]Apoptin对肝癌HepG-2细胞的凋亡和自噬作用研究[D]. 李一权. 延边大学, 2019(01)
- [9]重组溶瘤痘病毒rVV-CCL5-SSTR2-Luc+靶向治疗肿瘤的体外实验研究[D]. 方敬敬. 昆明理工大学, 2019(04)
- [10]自噬促进肝癌射频消融术后复发的作用及其分子机制研究[D]. 蒋家云. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)