一、姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用(论文文献综述)
王曦辉[1](2020)在《多功能纳米超声微泡的制备、表征及其靶向治疗卵巢癌的实验研究》文中认为背景卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。其发病率和死亡率较高的两大主要原因是:1)发现晚:目前现有的影像检查手段难以在发病初期及时诊断,因此很多患者被诊断时已处于晚期,失去了手术治疗的机会;2)耐药性:大部分患者对铂类药物初始治疗有效,但停止治疗后一段时间复发,间隔亦越来越短。因此,探究一种安全且行之有效的新型药物从而改善卵巢癌的诊断及治疗现状迫在眉睫。超声微泡是一类已经应用于临床超声诊断的超声造影剂。在超声的作用下微泡可以散射强超声信号,达到增强超声成像的目的。同时微泡也可以加强空化效应,因此在基因转染、药物传递等方面也有一些应用,然而目前的超声微泡大多为微米级,无法通过血管内皮间隙到达肿瘤组织部位,极大的限制了其应用。本研究旨在制备纳米级超声微泡CD44-NBs,以实现超声诊断与声动力治疗的有机结合。方法1)纳米超声微泡CD44-NBs的制备及表征:制备CD44-NBs纳米超声微泡;利用透射电镜及光学显微镜观察CD44-NBs纳米超声微泡的形貌及分散性;通过动态光散射系统测定其粒径分布及zeta电位;利用紫外可见光分光光度计检测姜黄素包封率及药物释放情况;体外超声辐照CD44-NBs后,观察其相变能力。2)纳米超声微泡CD44-NBs的体内外靶向性评价:首先探讨卵巢癌组织中CD44的表达与临床病理特征的关系;流式细胞仪分析卵巢癌细胞株CD44表达情况;流式细胞仪、激光共聚焦检测CD44-NBs纳米超声微泡对卵巢癌细胞株的体外靶向性;近红外活体成像检测其对卵巢癌荷瘤鼠的体内靶向性;通过体内外超声实验探究其超声成像效果。3)纳米超声微泡CD44-NBs靶向治疗卵巢癌的实验研究:通过CCK-8检测其体外安全性;通过血生化指标及病理切片检测其在体内的安全性;观察裸鼠的肿瘤生长情况、生存期分析等探究其体内治疗作用。4)纳米超声微泡CD44-NBs声动力治疗卵巢癌的杀伤机制研究:检测超声辐照CD44-NBs后活性氧的产率;通过细胞平板克隆、划痕迁移和侵袭实验探究其对卵巢癌恶性细胞生物学行为的影响;使用Western Blot和qRT-PCR检测其逆转肿瘤耐药相关机制。结果1)CD44-NBs纳米超声微泡在透射电镜下为圆形,表面较为光滑规则,分布均一,平均粒径为202.4±1.8 nm,分散性良好;姜黄素的包封率约为93.34%,载药量为8.7%,全氟己烷的包裹量约为77%;4°C放置一周,水合粒径和包封率均未发现明显改变,稳定性良好;在超声治疗仪上处理2分钟后,微泡平均直径为829.8±5.1 nm,CD44-NBs纳米微泡在超声激发后实现了纳米级向微米级的转变;使用紫外可见光分光光度计测得,随着超声处理时间的延长,材料中的姜黄素会被不断释放出来。2)探讨卵巢癌组织中CD44的表达与临床病理特征的关系发现:有腹水及淋巴转移的患者组织CD44的表达率更高;FIGO分期越高,CD44表达越强;流式细胞仪分析卵巢癌细胞株CD44表达情况:SKOV3细胞CD44表达高达99%,而ES-2细胞CD44表达为20%左右;流式细胞仪、激光共聚焦检测显示CD44-NBs纳米超声微泡对CD44阳性卵巢癌细胞株有较好的靶向性;近红外活体成像证实CD44-NBs纳米超声微泡可以更久地聚集在肿瘤组织中;体内外超声成像实验显示:相比脱气水的无回声信号,CD44-NBs纳米超声微泡在超声激发后显示为强回声信号,可以进行超声成像。3)纳米超声微泡CD44-NBs体内外安全性评价和治疗实验可以发现:在体外浓度达到100μg/m L时,CD44-NBs纳米超声微泡仍具有较好的细胞安全性;对荷瘤小鼠的主要脏器无明显损伤,血生化指标无明显异常,未对裸鼠自身产生其它毒副作用;CCK-8测得CD44-NBs+US组细胞存活率最低为10.45±5.8%,有较好的体外杀伤作用;体内通过观察小鼠瘤体变化、生存期以及肿瘤免疫组化发现CD44-NBs联合声动力治疗有较好的抑瘤效果。4)CD44-NBs纳米超声微泡在进行超声处理后活性氧的产率明显上升;通过探究其对卵巢癌恶性细胞生物学行为的影响发现CD44-NBs联合声动力治疗组细胞克隆形成率、迁移和侵袭能力都明显下降;使用Western Blot和qRT-PC发现CD44-NBs可以降低细胞P-gp表达、增加p38 MAPK、Beclin 1的表达,从而增强声动力治疗效果。结论本课题成功制备了靶向CD44的超声纳米微泡(CD44-NBs),其内部包裹有声敏剂姜黄素和可以提高肿瘤部位含氧量的全氟己烷。在低功率超声作用下,全氟己烷会经历从液相到气相的转变,使纳米级微泡转变为微米级微泡并成像;当微泡破裂时,包裹在其中的药物会释放出来,从而提高药物的治疗效果和靶向能力,也即在超声激发下,实现诊疗一体化。超声纳米微泡中全氟己烷既可以作为超声造影剂又可以为声动力治疗提供氧气,从而显着改善声动力治疗卵巢癌的疗效。总之,本研究为卵巢癌的诊断和治疗提供了一种潜在的新型治疗方案。
张玺[2](2020)在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中指出背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs),能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartic aminotransferase,AST)含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src(Src)是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析(Cellular thermal shift assay,CETSA)实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-(2-氨基)乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
付启瑞[3](2019)在《鳄胆素诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究》文中认为卵巢癌(Ovarain Cancer)是致死率最高的的妇科癌症,因缺乏快速精准的早期诊断方法,大多数患者被诊断出来时已经是中晚期,大约30%上皮性卵巢癌患者在不到五年的时间内死亡。胆汁被用来药用的历史悠久,中国多部古典书籍中均有关于动物胆汁功效的记载,但关于暹罗鳄鱼胆汁的应用国内外报道较少,我们实验室从暹罗鳄鱼胆汁中提取分离纯化出一种具备广谱性抗癌活性的鳄胆素,本论文以卵巢癌A2780和SKOV-3细胞为研究对象,对体外和体内两个方面研究鳄胆素对卵巢癌的生物学功效。在体外,我们首先采用MTT法测量鳄胆素对常见癌细胞生长的抑制作用,鳄胆素可以显着抑制卵巢癌A2780和SKOV-3细胞的生长,其IC50分别为37.4 μg/ml和67.3 μg/ml。集落形成能力实验显示,鳄胆素可以显着地降低卵巢癌细胞的克隆形成能力,此外鳄胆素作用卵巢癌48 h后,细胞周期分布发生了显着变化。细胞形态学观察发现,鳄胆素作用之后,细胞发生了一些类凋亡的表观特征,综合Western blot和RT-PCR实验结果,发现鳄胆素是通过Notch信号通路和Wnt信号通路诱导卵巢癌A2780细胞发生凋亡的。鳄胆素可以和阿霉素和姜黄素在特定浓度比例下产生较好的协同联合效应,同时联合用药也提示在进行联合用药时,要注意区分不同卵巢癌类型。在体内,建立BALB/c卵巢癌模型,通过动物活动、精神状态记录、体重指标、脏器系数和五脏病理学切片的实验结果,证明鳄胆素在给药剂量范围内的安全性,和厦门大学动物实验中心出具的急性毒理、慢性毒理实验报告相一致。鳄胆素作用之后,卵巢癌移植瘤的体积产生了较显着的变化,证明鳄胆素作用于卵巢癌的有效性。通过Western blot等分子生物学手段,检测发现,鳄胆素可以显着地降低增殖细胞核抗原和血管内皮生长因子的蛋白表达量,为动物表观数据提供了合理的机制解释。综上所述,通过对鳄胆素诱导卵巢癌A2780细胞凋亡的机制研索、联合常见化疗药物抑制卵巢癌生长组方的探索以及动物模型的建立,为鳄胆素在卵巢癌的临床治疗提供一定的基础理论。
邱扬[4](2019)在《新型姜黄素类似物L50H8体内外抗卵巢癌作用的研究》文中提出目的:联合应用二维静态细胞培养模式、三维动态细胞培养模式和体内实验,研究新型姜黄素类似物L50H8的抗卵巢癌作用,并对其作用的相关机制进行探究,为卵巢癌的治疗寻求新的药物选择,也为应用三维动态细胞培养模式进行抗肿瘤药物筛选和评估做进一步探索和论证。方法:首先在二维静态细胞培养模式下,噻唑蓝(MTT)比色法检测L50H8对卵巢癌细胞增殖作用的影响;流式细胞法检测L50H8对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响;Transwell法检测L50H8对卵巢癌细胞侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测L50H8对卵巢癌细胞周期调控因子Cyclin A和C yclin B mRNA表达的影响;蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测周期蛋白Cyclin A和Cyclin B,凋亡调控蛋白Bax、caspase8、cleaved-caspase3及凋亡诱导因子(AIF),内质网应激(ERS)相关蛋白GRP78和CHOP,细胞侵袭相关蛋白CD147、MMP2、MMP9、VEGF的表达。之后在海藻酸钠三维细胞支架和Tissue Flex三维灌注平台形成的三维动态细胞培养模式下,CASY细胞分析法检测L50H8对卵巢癌细胞增殖作用的影响;流式细胞法检测L50H8对卵巢癌细胞周期的影响;Hoechst33342和PI双染色,在激光共聚焦显微镜下观察卵巢癌细胞凋亡情况并统计凋亡率;qRT-PCR法检测L50H8对卵巢癌细胞Cyclin A和C yclin B mRNA表达的影响;Western Blot法检测周期蛋白Cyclin A和C yclin B,凋亡调控蛋白Bax、caspase8、cleaved-caspase3、AIF,ERS相关蛋白GRP78和CHOP,细胞侵袭相关蛋白CD147、MMP2、MMP9、VEGF的表达。最后进行裸鼠体内实验,观察L50H8对裸鼠卵巢癌移植瘤生长的影响,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率;TUNEL法检测L50H8对裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响;Western Blot法检测移植瘤组织中周期蛋白Cyclin A和C yclin B,凋亡调控蛋白Bax、caspase8、cleaved-caspase3、AIF,ERS相关蛋白GRP78和CHOP,肿瘤侵袭相关蛋白CD147、MMP2、MMP9、VEGF的表达。结果:1.二维静态细胞培养模式下,L50H8能显着抑制卵巢癌细胞增殖。在SKOV3细胞,L50H8的IC50为2.71±0.08μM;在OVCAR3细胞,L50H8的IC50为3.08±0.08μM。在SKOV3细胞,L50H8能增加S期细胞比例;在OVCAR3细胞,L50H8能增加G2/M期细胞比例。在SKOV3细胞,L50H8能下调周期因子Cyclin A的mRNA和蛋白表达;在OVCAR3细胞,L50H8能下调周期因子Cyclin B的mRNA和蛋白表达。L50H8能促进卵巢癌细胞的凋亡,上调促凋亡因子Bax及AIF的表达,对caspase8蛋白表达无明显影响,cleaved-caspase3未见表达。L50H8能诱导ERS,促进GRP78和CHOP蛋白的表达。L50H8能明显降低卵巢癌细胞的侵袭能力,下调CD147、MMP2、MMP9和VEGF蛋白的表达。2.三维动态细胞培养模式下,L50H8同样能显着抑制卵巢癌细胞增殖,在SKOV3细胞,L50H8的IC50为4.73±0.22μM;在OVCAR3细胞,L50H8的IC50为5.09±0.18μM,三维动态实验中L50H8的IC50高于二维模式实验结果(P<0.01)。在SKOV3细胞,L50H8能增加S期细胞的比例,在L50H8-10μM组还能引起G2/M期细胞比例增加;在OVCAR3细胞,L50H8对各周期的细胞比例无明显影响。在SKOV3细胞,L50H8能下调Cyclin A的mRNA和蛋白表达;在OVCAR3细胞,L50H8能下调Cyclin B的mRNA和蛋白表达。L50H8能促进卵巢癌细胞的凋亡,相同浓度下,三维动态实验中L50H8诱导细胞凋亡率低于二维静态实验结果(P<0.05)。L50H8能上调Bax及AIF的表达,对caspase8蛋白表达无明显影响,cleaved-caspase3未见表达。L50H8能诱导ERS,促进GRP78和CHOP蛋白的表达。L50H8能下调CD147、MMP2、MMP9和VEGF的表达。3.在裸鼠体内实验,L50H8能显着抑制卵巢癌细胞移植瘤的生长,促进移植瘤内癌细胞凋亡。L50H8能下调移植瘤组织Cyclin B蛋白的表达,上调促凋亡因子Bax及AIF的表达,L50H8能上调ERS相关蛋白GRP78和C HOP的表达,下调肿瘤侵袭相关蛋白CD147、MMP2、MMP9和VEGF的表达。L50H8对裸鼠心脏、肝、肾未见组织学层面的损伤,但不排除存在其它方面药物毒性可能。结论:1、L50H8在体外和体内实验均表现出对卵巢癌良好的抗肿瘤活性,有可能成为新的抗卵巢癌候选药物。2、L50H8的作用机制可能包括影响细胞周期、诱导细胞凋亡和内质网应激、减弱肿瘤侵袭能力等,值得进一步深入研究。3、L50H8的凋亡诱导效应不依赖线粒体caspase通路,可能通过上调BAX激活AIF途径实现。4、三维动态培养能使细胞在更接近体内的状态下生长,是更具优势的体外细胞实验模式。
相萌,刘棣[5](2014)在《姜黄素单独及联合顺铂对人卵巢癌细胞株3AO,SKOV3增殖及其对Notch1,Hes1信号表达的影响》文中研究表明目的:检测姜黄素与顺铂单独及联合作用对SKOV3、3AO细胞体外生长及其对Notch1/Hes1信号mRNA表达变化的影响,证实姜黄素通过Notch信号途径影响卵巢癌细胞增殖及可能通过Notch信号途径增加顺铂的化疗敏感性。方法:采用RT-PCR检测姜黄素与顺铂单独及联合作用于人卵巢癌细胞株3AO,SKOV3对Notch1,Hes1信号表达的影响。结果:1 RT-PCR分别检测经不同浓度姜黄素及顺铂处理后的Notch1,Hes1信号表达,灰度分析结果作单因素方差分析,姜黄素组与阴性对照组比较,组间及组内差异均有显着性差异(P<0.05),姜黄素下调目的基因条带的表达。顺铂组与阴性对照组比较有显着性差异(P<0.05),顺铂增强Notch1,Hes1信号表达;2RT-PCR检测经不同浓度(80、40、20μg/ml)姜黄素联合顺铂1.25μg/ml处理后的Notch1,Hes1信号表达,与姜黄素单独作用比较,灰度分析结果作单因素方差分析有显着性差异(P<0.05)。联合用药下调目的基因条带的表达,其可能通过干预Notch1-hes1信号途径发挥协同作用。结论:Notch1信号与肿瘤增殖相关,姜黄素可能通过干预癌细胞的Notch1-hes1信号途径抑制肿瘤细胞的增殖,增加化疗敏感性,与顺铂发挥协同作用。
徐梅[6](2014)在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中提出卵巢癌发病隐匿,大部分患者就诊时已经是晚期,位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此,它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展,肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性,又具有非MHC限制性杀瘤的优点,近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗,但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂(cis-Dichloro diamine in platinum,CDDP或DDP)、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应,接着通过体内实验研究氟尿嘧啶(5-FU)、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用,初步探讨其作用机制。最后,回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料,初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性,为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的:探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法:利用人外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞,于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比;于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞,用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞,于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况,同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组;杀伤实验分为A14CIK细胞作用组(效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1)、B17DDP作用组(DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)及C12CIK联合DDP作用组(DDP浓度均为2.5μg/ml,效靶比分别为5:1和10:1)。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果:CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为(1.8±0.2)×107、(14.67±1.53)×107、(230.0±20.0)×107、(225.0±22.91)×107及(220.0±17.32)×107,细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍,达到增殖高峰;CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为(0.47±0.17)%、(11.30±1.96)%、(35.50±2.30)%、(38.23±1.92)%、(31.40±3.91)%和(28.61±3.45)%,到21天也达到增殖高峰;SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为(12.30±1.47)%和(27.13±2.03)%,差异有统计学意义(P <0.05)。对照组24h及48h凋亡率分别为(0.62±0.35)%和(0.65±0.38)%,差异无统计学意义(P>0.05);A14CIK作用组24h抑制率分别为(16.52±2.52)%、(24.18±4.05)%、(35.98±5.19)%及(53.98±5.02)%,48h抑制率分别为(24.20±5.59)%、(41.23±3.64)%、(57.27±6.68)%及(74.74±6.87)%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义(P <0.05),相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义(P <0.05);CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高;B17DDP作用组24h抑制率分别为(15.09±4.03)%、(25.95±3.36)%、(37.11±3.05)%、(50.07±5.21)%、(62.93±5.85)%、(77.93±3.28)%及(92.55±1.39)%,48h抑制率分别增为(23.42±5.63)%、(32.39±1.47)%、(46.04±2.76)%、(60.46±3.26)%、(72.77±2.38)%、(86.42±1.46)%及(96.24±0.59)%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义(P=0.102),其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高;C12CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为(50.50±3.69)%和(68.19±2.07)%,48h抑制率分别为(69.87±2.67)%和(80.11±6.87)%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比,对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示,低剂量组(效靶比为5:1)24h和48h抑制率未见到协同效应(P值分别为0.171和0.895),而高剂量组(效靶比为10:1)24h和48h抑制率见到协同效应(P <0.05)。结论:PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞,其主要效应细胞(CD3+CD56+CIK)在第1421天为高表达平台期,在此期间可获得较为理想的效应细胞;CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用;联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的:探讨氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法:建立BALB/C小鼠结肠癌模型,在体外诱导培养小鼠CIK细胞,于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组,一组给5-FU(12.5mg/kg)当天腹腔注射,另一组给予NS(0.2ml/只)腹腔注射作对照,第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4,CTLA-4)和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组,A组(正常对照组):NS(0.2ml腹腔灌注,d0)+NS(0.2ml尾静脉注射,d3);B组(5-FU组):5-FU(12.5mg/kg腹腔灌注,d0)+NS(0.2ml尾静脉注射,d3);C组(CIK组):NS(0.2ml腹腔灌注,d0)+CIK(1×107尾静脉注射,d3);D组(5-FU+CIK组):5-FU(12.5mg/kg腹腔灌注,d0)+CIK(1×107尾静脉注射,d3)。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线,生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠,采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果:小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到(18.4±6.8)%。与对照组相比,5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高,且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加;5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组,差异有统计学意义(P <0.05);5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量,且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义(P <0.05)。结论:5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用,且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第三部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的:初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性,为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法:利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞,在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞,流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第1421天的CIK细胞通过静脉回输给患者,流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化,回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料,观察患者治疗前后卡式评分(Karnofsky performance score,KPS)差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果:有5例治疗后KPS较治疗前明显提升,另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高,在接受CIK细胞治疗3个疗程后,CA199逐渐下降至正常。目前状况良好,肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象,无瘤生存期(progression free survival,PFS)已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者,接受CIK细胞治疗2个疗程,PFS已接近4年,随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后,PFS已达5年,目前状况良好,也没有肿瘤复发迹象。结论:CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量,是一种有希望的治疗方法。综上所述,本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析,我们认为,CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增,第1421天可获得较为理想的效应细胞;CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用;联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用;5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞,且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量,是一种有希望的治疗方法。
庞迎新[7](2014)在《miRNA-519d、双联苄化合物DHA2对卵巢癌的生长抑制作用及其机制研究》文中指出研究背景卵巢癌(ovarian cancer, OCa)是女性生殖器官肿瘤中常见的恶性肿瘤,其死亡率在妇科恶性肿瘤高居于首位。卵巢癌发病隐匿,大于2/3的患者出现症状时已经属于晚期。肿瘤细胞减灭术和以铂类化疗药物为主的联合化疗是晚期卵巢癌的主要治疗策略,可暂时缓解病情,然而70%的患者在3年内复发。复发后的卵巢癌耐药性增强,恶性程度增加,严重影响患者的预后及生存质量,使患者5年生存率大大下降。因此,探讨EOC的分子发病机制,寻找新型的和选择性强的抗卵巢癌药物,提高化疗敏感性或逆转耐药,对指导卵巢癌治疗具有重要意义。新型抗肿瘤药物研究的热点主要集中在以下两方面:(1)针对OCa的发生发展机制,探寻新分子作用靶点;(2)从天然产物(植物、海洋生物等)中寻找新的活性成分。MicroRNA(简称1miRNA)是近年来发现的一类长约22nt内源性非编码的小RNA分子,主要通过靶向到mRNA的3’UTR进而调控基因的表达,引起靶mRNA降解或蛋白翻译的抑制。研究发现,miRNA参与了多种生命活动,包括个体发育、细胞凋亡、增殖和代谢等。miRNA的表达具有组织特异性;在多肿瘤组织中往往表达失调,与包括卵巢癌在内的多种肿瘤的发生发展、耐药等病理进程密切相关,对肿瘤的诊断、治疗和判断预后有重要的指导意义。约有半数的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区或脆性位点,通过调控体内相应的癌基因或抑癌基因的表达,进而发挥重要的致癌或抑癌因子的功能。与正常卵巢组织相比,卵巢癌组织有特异的miRNA表达谱。文献显示miR-519d在晚期卵巢癌中表达下调,但下调机制有待进一步阐明。而且,miRNA通过影响细胞凋亡或相关信号通路参与卵巢癌化疗耐药的形成。因此,恢复失衡的miRNA的表达已经成为一个崭新的、有发展前景的巢癌治疗的新方向。天然药物是人类防病治病、药物研发的重要源泉。如卵巢癌一线化疗药物紫杉醇即为从红豆杉属植物中分离纯化得到的一类二萜类化合物。其抗癌机制主要为促进微管聚合、稳定微管,阻断正常的有丝分裂,发挥治疗卵巢癌的作用。大多数卵巢癌患者治疗效果较好,但20%以上的患者对紫杉醇耐药。因此,新型的天然抗肿瘤药物的寻找又成为热点。双联苄类化合物是从苔藓类植物中提取并分离得到的一类大环多酚类化合物,具广泛的生物学活性,如抗炎、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等,是一类发展前景良好的抗癌新药。Dihydroptychantol (DHA)是双联苄化合物的一种,本课题组前期研究发现,其在多种肿瘤细胞株中可显着抑制细胞增殖、促进细胞凋亡;DHA还可诱导其他类型的细胞死亡,如自噬性死亡。然而,双联苄化合物的抗卵巢癌活性未有报道,其具体作用机制有待于进一步研究。第一部分:miR-519d通过靶向调控XIAP抑制卵巢癌细胞增殖及增强顺铂敏感性的研究研究目的:检测miR-519d在卵巢癌细胞系和组织中的表达,探讨其对卵巢癌细胞增殖的影响和与顺铂敏感性的关系。通过预测并验证miR-519d靶基因,揭示miR-519d的作用机制。材料方法:应用TaqMan探针法检测卵巢癌细胞系(OVCAR3、SKOV3及A2780)上皮性卵巢癌组织及正常卵巢组织的miR-519d的表达。转染miR-519d mimics或inhibitors实现miR-519d在卵巢癌细胞的上调或下调,采用MTT法检测对卵巢癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,western blot法检测凋亡相关蛋白表达。生物信息学预测miR-519d的靶基因,构建双荧光报告基因系统验证miR-519d与靶基因XIAP的关系。实验结果:1. miR-519d在卵巢癌细胞系及卵巢癌组织中的表达情况应用TaqMan探针实时定量PCR(qRT-PCR)法检测卵巢癌细胞系(OVCAR3、 SKOV3及A2780)及上皮性卵巢癌组织7例和正常卵巢组织2例中的1miR-519d的表达。结果显示:卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3及A2780中miR-519d的表达水平显着低于正常卵巢组织,差异具有统计学意义(P<0.001)。上皮性卵巢癌7例组织中miR-519d的表达均较正常组织明显降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。2.转染miR-519d对卵巢癌细胞增殖的影响在A2780及SKOV3细胞中转染miR-519d mimics及inhibitors48h后,应用TaqMan探针qRT-PCR法检测miR-519d的表达。结果显示:转染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3细胞内的miR-519表达明显上调,分别为对照组的3985.33±400.05倍和2260.97±541.25倍。而转染miR-519d inhibitors后,A2780及SKOV3细胞的miR-519d表达显着被抑制,分别是对照组的0.32±0.07倍和0.08±0.02倍。在A2780及SKOV3细胞中转染miR-519d mimics48h及72h后,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测A2780及SKOV3细胞增殖能力。结果显示:上调A2780细胞内miR-519d水平后,48h及72h的A2780细胞增殖抑制率分别为:(15.50±3.62)%和(29.70±8.31)%,与对照相比差异具有统计学意义(P值分别为0.004及0.03)。上调SKOV3细胞内的miR-519d水平对其增殖能力无明显影响。3.转染miR-519d对卵巢癌细胞的顺铂敏感性的影响3.1.转染miR-519d对顺铂诱导的卵巢癌细胞增殖抑制作用的影响在A2780及SKOV3细胞中转染miR-519d mimics48h后,联合应用不同浓度梯度的顺铂(25,50,100μM)作用24h。应用MTT法检测A2780及SKOV3细胞的增殖能力,结果显示:顺铂25μM作用于A2780细胞24h后,miR-519d转染组与阴性对照组的细胞增殖率分别为(27.01±1.65)%和(38.18±1.48)%(P<0.05);顺铂501μM作用时,miR-519d转染组与阴性对照组的A2780细胞增殖率分别为(19.40±1.46)%和(30.07±5.76)%(P<0.05);顺铂100μM作用时,miR-519d转染组与阴性对照组的A2780细胞增殖率分别为(13.38±1.34)%和(20.92±2.23)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染miR-519d的SKOV3细胞经顺铂作用后,细胞增殖率变化趋势与A2780细胞一致。3.2.转染miR-519d对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡作用的影响在A2780及SKOV3细胞中转染miR-519d mimics48h后,联合应用不同浓度的顺铂(25,50μM)作用24h,应用流式细胞术检测A2780及SKOV3细胞的凋亡率,结果显示:顺铂25μM作用于A2780细胞24h后,miR-519d转染组与阴性对照组的晚期凋亡率分别为(60.72±3.59)%和(46.82±2.38)%(P<0.05)。50μM顺铂作用时,转染1niR-519d组与阴性对照组的晚期凋亡率分别为(77.65±4.78)%和(67.26±5.35)%(P<0.05)。对于SKOV3细胞,早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞均较对照组增加。应用western blot法检测A2780及SKOV3细胞中凋亡相关蛋白的表达,结果显示:顺铂50μM作用于A2780和SKOV3细胞24h后,miR-519d转染组的酶原形式Caspase-3表达均较对照组降低,而Caspase-3及其底物PARP的剪切形式较对照组增加,表明1miR-519d加速了细胞凋亡进程。4. miR-519d靶基因的预测及其在A2780和SKOV3细胞中的验证TargetScan在线预测XIAP的3’UTR有两个miR-519d的结合位点,分别是1228-1234位点及4925-4931位点。在A2780及SKOV3细胞中转染miR-519d mimics或inhibitors48h后,western blot法及qRT-PCR法分别检测XIAP的蛋白及mRNA表达。结果显示:转染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3细胞内XIAP的蛋白表达水平分别是对照组的0.39±0.06倍和0.62±0.06倍(P值均小于0.05);转染miR-519d inhibitors48h后,A2780及SKOV3细胞内XIAP的蛋白表达水平分别是对照组的1.32±0.03倍和1.29±0.02倍(P值均小于0.05); XIAP mRNA的表达与蛋白的表达趋势完全一致。分别构建含有Targetscan预测的两个结合位点的XIAP3’UTR片段的双荧光素酶表达载体,与miR-519d共转染SKOV3细胞48h后,检测相对荧光素酶的表达活性。结果发现:野生型XIAP3’UTR (position1228-1234)双荧光报告基因载体组的荧光素酶相对活性明显低于突变型XIAP3’UTR组(89.28±15.83vs.167.37±21.34),差异有统计学意义(P<0.05)。构建的4925-4931位点的荧光素报告载体的实验结果与1228-1234位点的相一致。5. XIAP siRNA对卵巢癌细胞增殖及顺铂敏感性的影响5.1. XIAP siRNA在A2780及SKOV3细胞中干扰作用的验证XIAP siRNA作用于A2780及SKOV3细胞48h后, western blot法检测XIAP的蛋白表达,结果显示:转染XIAP siRNA的A2780及SKOV3细胞内XIAP蛋白的表达均为阴性。5.2. XIAP siRNA对卵巢癌细胞增殖的影响在A2780及SKOV3细胞中转染XIAP siRNA48h和72h后,MTT法检测A2780及SKOV3细胞增殖能力,结果显示:转染XIAP siRNA48h和72h后的A2780细胞增殖抑制率分别为(18.53±7.75)%和(24.84±3.70)%,与对照相比差异具有统计学意义(P<0.05);XIAP siRNA对SKOV3细胞的增殖能力无明显影响(P>0.05)。5.3. XIAP siRNA对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡作用的影响在A2780及SKOV3细胞中转染XIAP siRNA48h后,联合应用不同浓度的顺铂作用24h,应用MTT法检测卵巢癌A2780及SKOV3细胞的增殖能力,结果显示:顺铂50μM作用于A2780细胞24h后,XIAP siRNA干扰组与阴性对照组的A2780细胞增殖率分别为(37.75±1.95)%和(49.57±2.26)%,差异有统计学意义(P<0.05);顺铂100μM作用时,XIAP siRNA干扰组与阴性对照组的A2780细胞增殖率分别(16.52±5.29)为和(31.02±1.0)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染XIAP siRNA的SKOV3细胞经顺铂作用后,细胞增殖率变化趋势与A2780细胞一致。在A2780及SKOV3细胞中转染XIAP siRNA48h后,联合应用不同浓度的顺铂作用24h,应用western blot法检测A2780和SKOV3细胞中凋亡相关蛋白的表达,结果显示:顺铂50μM作用于A2780和SKoV3细胞24h后, XIAP siRNA干扰组的Caspase-3及其底物PARP的剪切形式增加。6.卵巢癌细胞及组织中XIAP的表达情况应用TaqMan探针qRT-PCR法检测OVCAR3、SKOV3及A2780细胞内的miR-519d的表达情况,结果以2-ΔCT×103值表示,分别为1.572±0.033,1.474±0.026及0.299±0.007。应用qRT-PCR法及western blot法分别检测三株卵巢癌细胞系XIAP mRNA和蛋白水平的表达,结果显示:XIAP mRNA定量结果以2-ΔcT×103值表示分别为0.003±0.002,47.62±2.33及49.68±21.32,XIAP蛋白水平的表达趋势与mRNA水平完全一致,表明XIAP的表达与miR-519d表达呈负相关。应用western blot法检测7例上皮性卵巢癌组织与2例正常卵巢组织XIAP蛋白的表达,结果显示:卵巢癌组织中XIAP蛋白表达水平与正常卵巢组织相比均显着上调,与miR-519d表达呈负相关。结论:1. miR-519d抑制卵巢癌SKOV3及A2780细胞增殖,增强其对顺铂作用的敏感性。2. miR-519d通过调控XIAP表达发挥抑癌基因功能。第二部分双联苄化合物DHA2通过调控XIAP及AKT/mTOR信-号-通路抑制卵巢癌作用机制的研究研究目的:检测DHA2对卵巢癌细胞凋亡和自噬的影响,探讨其作用机制,动物实验验证DHA2的抑瘤效果。材料方法:DHA2作用于卵巢癌细胞后,MTT法检测卵巢癌细胞的增殖能力,western blot检测细胞中凋亡、自噬相关蛋白及AKT/mTOR通路蛋白的表达变化,PI/Annexin V双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞仪检测细胞死亡率,吖啶橙染色流式细胞仪检测AVOs的形成,免疫荧光染色检测细胞中LC3的表达,针对XIAP基因,设计并构建XIAP真核表达质粒,H&E染色及免疫组化染色检测裸鼠移植瘤的凋亡、自噬及增殖相关蛋白的表达变化。实验结果:1.DHA及DHA1-3活性的细胞系筛选及其对卵巢癌细胞的生长抑制作用应用不同浓度的DHA及DHA1-3处理四种卵巢癌细胞系24h后,MTT法检测四种卵巢癌细胞系的增殖。结果显示:DHA及其衍生物DHA1-3对卵巢癌细胞系SKOV3、A2780、3A0和OVCAR3均有不同程度的增殖抑制作用,且呈剂量依赖性。DHA2对SKOV3,3AO和A2780细胞增殖的IC50值分别为13.44±0.84μmol/L,4.04±0.33μmol/L和19.80±1.08μmol/L, DHA2对正常视网膜上皮细胞RPE1细胞则毒性很小,IC50值为471.72±94.02μmol/L。2.DHA2诱导卵巢癌SKOV3细胞死亡的机制研究2.1DHA2对卵巢癌SKOV3细胞形态学的影响不同浓度的DHA2作用于SKOV3细胞24h后,镜下观察细胞形态变化,结果显示:在DHA25μM作用时,细胞体积略增加,细胞质密度增加;在DHA2作用时,细胞胞浆内出现大小不等的空泡,细胞边缘不规则;在DHA215μM时,细胞变圆,皱缩,与邻近细胞脱离。2.2DHA2对卵巢癌SKOV3细胞死亡的影响不同浓度的DHA2作用于SKOV3细胞24h后,应用流式细胞仪检测SKOV3细胞凋亡率,结果显示:DHA25μM,10μM和15μM诱导的SKOV3的细胞死亡率分别为25.01%,56.03%和58.44%。通过测定LDH的泄漏率来评价细胞损伤的程度,结果显示:细胞内的LDH释放呈剂量依赖性增加,DHA215μM处理时,LDH的泄漏率较对照增加4倍左右(904±97vs.238±12,P<0.01)。应用广谱Caspase家族抑制剂z-VAD-fmk(20μM)或坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1(30μM)预处理细胞2h后,加入12.5μM DHA2继续作用12h,流式细胞术检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:广谱Caspase抑制剂z-VAD-fmk对DHA2诱导的SKOV3细胞死亡无显着逆转作用(18.75±4.28%vs.14.04±2.74%)(P>0.05)。应用坏死抑制剂necrostatin-1对DHA2诱导的SKOV3细胞死亡亦无明显作用(23.18±1.86%vs.24.04±3.79%)(P>0.05)。2.3DHA2对卵巢癌SKOV3细胞内凋亡相关蛋白表达的影响不同浓度的DHA2(5,10,15pM)作用于SKOV3细胞24h后,western blot方法检测SKOV3细胞中凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示:DHA2诱导的死亡伴随着抗凋亡蛋白XIAP、Bcl-2的下调,促凋亡蛋白Bax的上调,Bcl-2/Bax比值下调,呈时间和剂量依赖性;Caspase的底物PARP的剪切形式在SKOV3细胞中无明显增加。2.4. XIAP在DHA2诱导的SKOV3细胞死亡的作用构建XIAP过表达载体,在SKOV3细胞中转染XIAP过表达载体24h后,继续应用12.5μMDHA2处理12h,应用流式细胞仪检测SKOV3细胞死亡率,结果显示:过表达XIAP几乎可完全逆转DHA2诱导的SKOV3细胞死亡(31.87±3.53%vs.7.44±4.37%)(P<0.05)。设计XIAP siRNA,转染SKOV3细胞48h后,继续应用12.5μM DHA2处理12h,应用流式细胞仪检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:干扰XIAP表达能显着增加卵巢癌细胞对DHA2的敏感性(20.41±6.98%vs.33.79±5.02%)(P<0.05)。3.DHA2对卵巢癌SKOV3细胞自噬的影响3.1.DHA2对卵巢癌SKOV3细胞自噬溶酶体的作用DHA212.5μM处理SKOV3细胞12h和24h,应用AO染色流式细胞术检测处理后SKOV3细胞内的酸性自噬溶酶体空泡(AVOs)的形成。结果显示:随着DHA2作用时间的延长,AO染色的荧光强度明显向右偏移,提示DHA2诱导细胞自噬体的形成。3.2.DHA2对SKOV3细胞内自噬相关蛋白的表达影响DHA212.5μM处理SKOV3细胞不同时间后,应用免疫荧光染色检测LC3蛋白的表达。结果显示:DHA2处理的SKOV3细胞自6h开始于胞浆内逐渐出现红色荧光斑点,随着作用时间的延长,荧光斑点数量明显增加,荧光强度也随之增强。不同浓度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3细胞24h,或者]2.5μMDHA2作用于SKOV3细胞不同时间后,应用western blot法检测SKOV3细胞中自噬相关蛋白的表达,结果显示:DHA2在卵巢癌SKOV3细胞中以剂量依赖性及浓度依赖性的方式诱导LC3-II的表达上调,同时促进了LC3-I向LC3-II的转化;自噬降解底物p62表达随着药物作用时间的增加逐渐降低;其他自噬相关蛋白如ATG5、Beclinl的表达变化不明显。qRT-PCR法检测自噬相关基因的mRNA的表达水平,结果显示:经DHA2作用后,自噬相关基因Atg5、Atg7、Atg12、 Beclinl等的mRNA表达无明显变化。3.3.自噬抑制剂对DI-IA2诱导的SKOV3细胞死亡的影响应用自噬抑制剂(E64D/Pepstatin A或氯喹)预处理SKOV3细胞2h后,再应用DHA212.5μM处理SKOV3细胞12h,流式细胞术检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:E64D/Pepstatin A联合DHA2作用比DHA2单独作用时细胞死亡率明显增加(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P<0.05);应用氯喹阻断自噬后也明显增强DHA2介导的细胞死亡(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P<0.05)。在SKOV3细胞中转染ATG5siRNA48h后,再应用DHA212.5μM处理12h,流式细胞术检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:应用ATG5siRNA能有效阻断LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,并增强DHA2诱导的细胞死亡。4.DHA2诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬的机制研究4.1.DHA2对AKT/mTOR信号通路的影响不同浓度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3细胞24h,或者12.5pM DHA2作用于SKOV3细胞不同时间后,western blot方法检测细胞中AKT/mTOR通路中相关蛋白的表达情况。结果显示:15μM DHA2可明显抑制p-AKT.p-mTOR的活性,而对AKT和mTOR总蛋白的表达没有明显影响。在作用时间上,DHA2作用3h即可引起p-AKT的明显下调,随作用时间的延长,p-AKT的活性持续下调。对于p-mTOR, DHA2作用9h也出现显着下调。4.2. XIAP对DHA2诱导的SKOV3细胞自噬的影响XIAP siRNA处理SKOV3细胞48h后,应用12.5μMDHA2继续作用12h,应用western blot法检测SKOV3细胞中相关蛋白表达情况。结果显示:转染XIAP siRNA的SKOV3细胞中,LC3-II/-I值为阴性对照组的1.6倍。DHA2单独作用的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值为8.83,而敲除XIAP后使DHA2引起的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值上调至12.24。4.3.AKT在DHA2诱导的SKOV3细胞死亡与自噬中的作用在SKOV3细胞中转染AKTl-Myr载体48h后,应用12.5μM DHA2继续作用12h, western blot检测SKOV3细胞中相关蛋白表达,流式细胞术检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:转染AKT1-Myr载体48h后,p-AKT的水平明显上调,并伴随着LC3-II的表达下调,而且能部分逆转DHA2引起的细胞死亡(31.47±2.68%vs.12.34±3.05%,P<0.01)。应用PI3K抑制剂LY294002预处理SKOV3细胞2h后,应用12.5μMDHA2继续作用12h, western blot检测SKOV3细胞中相关蛋白表达,流式细胞术检测SKOV3细胞死亡率。结果显示:LY294002可显着降低p-AKT的活性,增加LC3-II的积累,并显着增强DHA2诱导的细胞死亡(17.53±2.62%vs.32.26±2.04%,P<0.01)。5.DHA2对SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的影响5.1.DI-IA2对SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用建立卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠动物模型,建模成功后随机分为对照组、DHA2低浓度组(15mg/kg)和DHA2高浓度组(30mg/kg),隔日腹腔用药,连续两周。结果显示:低剂量和高剂量DHA2均显着地抑制肿瘤的生长,瘤块体积和瘤重的减少较对照组有统计学差异(P<0.05)。根据不同时间点的肿瘤体积绘制肿瘤的生长曲线,结果显示:DHA2给药组能显着地抑制肿瘤生长;随着给药时间的延长,抑瘤效果更加明显。低剂量组和高剂量组的肿瘤体积抑制率分别为48.76%和41.79%,两剂量组间无统计学差异。应用western blot方法检测了各组肿瘤组织中凋亡相关及自噬相关蛋白的表达,结果显示:DHA2给药组的肿瘤组织中XIAP的表达低于对照组,p-AKT、p-mTOR及LC3的表达变化与细胞实验完全一致。采用H&E染色法对肿瘤组织进行形态学特征的观察,结果显示:DHA2抑制了肿瘤细胞的分化,并伴随着局部肿瘤组织的坏死。应用免疫组化检测Ki67的表达情况,结果显示:三组的Ki67比率分别为对照组(55.62±22.92)%,低剂量组(1.31±11.14)%,高剂量组(5.4±7.81)%,差异具有统计学意义(P<0.01vs.对照组)。免疫组化结果显示:DHA2给药组中XIAP、p-AKT和p-mTOR表达较对照组降低,而LC3表达高于对照组。5.2.DHA2对移植瘤模型的骨髓抑制作用及肝肾毒性研究血常规结果显示,各组间白细胞、血红蛋白及血小板的水平无明显差异,提示DHA2对骨髓造血功能无明显的抑制作用。对各组的肝、脾、肾器官进行H&E染色未发现有明显的组织学异常改变。肝肾功能血液学结果显示,高剂量组中的谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平较对照组和低剂量组有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05);各组间的血清肌酐(SCr)水平无明显差异,而高剂量组中的尿素氮(BUN)水平比对照组和低剂量组有所升高(P<0.05)。结论:1.DHA2在卵巢癌中具有生长抑制作用。2.AKT在DHA2诱导的SKOV3细胞死亡中发挥重要调控作用。3.DHA2有可能成为治疗卵巢癌的新型天然药物。
尹凤玲[8](2013)在《4-HPR联合DDP对卵巢癌细胞株SKOV3增殖抑制作用的实验研究》文中研究指明第一部分4-HPR联合DDP对卵巢癌细胞株增殖抑制作用的体外实验研究目的:4-羟苯基维胺脂(N-4-hydroxyphenyl retinode,4-HPR)是一种全反式维甲酸的衍生物,实验研究和部分临床实验表明,它对各种肿瘤有化学预防和治疗双重作用;顺铂(cisi-platin,DDP)是卵巢癌常用的化疗药物,但因其毒副作用及其耐药等问题,临床应用受到限制。本研究探讨在体外环境下,4-羟苯基维胺酯(4-HPR)联合顺铂(DDP)对人卵巢癌细胞株SKOV-3增殖及凋亡的影响。方法:4-HPR单药,DDP单药及4-HPR+DDP联合用药方式多种剂量分别干预人卵巢癌细胞株SKOV-3; MTT法检钡SKOV-3细胞增殖抑制率变化;中效原理法判断联合用药的相互作用;HOCHST和流式细胞单染和双染分析凋亡细胞比例。实验结果计量资料以均数±标准差表示。应用SPSS13.0统计分析软件进行t检验,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果:MTT检测方法结果:1、两种药物单独使用时均具有剂量依赖性和时间依赖性。2、DDP:药物作用48小时,各相邻药物浓度组之间,只有DDP20μM与DDP10μM浓度组之间有统计学差异(P<0.05);药物作用72小时,从DDP2.5μM浓度组开始均与相邻药物浓度组之间有统计学差异。3、4-HPR;药物作用48小时,各相邻药物浓度组之间,只有4-HPR20μM与4-HPR10μM浓度组之间有统计学差异;药物作用72小时,从4-HPR10μM至4-HPR20μM浓度组均与相邻药物浓度组之间有统计学差异。4、两种药物联合应用后,根据中效浓度的计算,除4-HPR1μM+DDP5μM在48h的联合应用组外,在其余48h与72h的所有联合应用组,均CI<1,即两种药物联合应用产生了协同作用的效果。HOECHST检测方法:1)DDP与4-HPR在作用SKOV-3细胞株72h后,两种药物单独使用时,均具有剂量依赖性。2)DDP与4-HPR的联合应用,根据中效浓度的计算,4-HPR5μM+DDP组和4-HPR10μM+DDP5μM组均为CI<1,即两种药物联合应用产生了协同作用的效果。流式双染检测法结果:1)DDP与4-HPR在作用SKOV-3细胞株72h后,两种药物单独使用时均具有剂量依赖性。2)DDP与4-HPR的联合应用,根据中效浓度的计算,三组药物联合应用组均为CI<1,即两种药物联合应用产生了协同作用的效果。流式单染检测法:1)DDP与4-HPR联合应用组:DDP通过降低G1期细胞的比例,主要将细胞阻滞在G2期,抑制SKOV-3细胞的增殖,而4-HPR主要将细胞阻滞在S期和G2期。联合应用两种药物的效果综合了两种药物的单独作用效果。结论:SKOV-3细胞在4-HPR5μM+DDP5μM和4-HPR10μM+DDP5μM联合作用72h后,能够产生明显的抑制增殖的作用,且作用协同,其中4-HPR的使用浓度越高,抑制效应越明显。第二部分4-HPR联合DDP对卵巢癌移植瘤增殖抑制作用的体内实验研究目的:建立人卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型,探讨4-HPR和DDP单独应用及联合应用对移植瘤的作用,进一步探讨其作用机制。方法:先培养人卵巢癌细胞株SKVO-3,用细胞悬液接种法制备荷瘤鼠模型1只;再用套管针组织块接种法进行皮下接4-HPR组种,共接种30只裸鼠;观察成瘤情况;分组后腹腔分别给药:(1)对照组:生理盐水;(2)4-HPR组:8mg/kg;(3)顺铂组:3mg/kg;(4)联合用药组:4-HPR8mg/kg,4-HPR给药6小时后给顺铂3mg/kg,均为腹腔注射给药,一次注射剂量为0.2ml,每周两次,共三周。每周测量肿瘤长、短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,取瘤组织进行病理学检查;免疫组织化学S-P法检测瘤组织Caspase-3蛋白的表达;检测细胞凋亡率和细胞周期变化。结果:用2.5×1010个/只细胞悬液接种成功制备荷瘤鼠一只,套管针皮下接种SKVO-3瘤块后,2~3天皮丘消平,约4~5天可见微小的肿瘤结节,接种成功率为100%。治疗结束时测移植瘤体积分别为4937.72±563.28mm3、3726.34±462.32mm3、2687.78±631.91mm3、1532.69±723.84mm3,抑瘤率分别为0.00%、30.21%、42.78%、61.37%。移植瘤体积,各处理组均小于对照组,联合用药组小于单药组,差异均有统计学意义(p<0.05);肿瘤组织病理:剖视肿瘤,对照组大部分呈类圆形,有的肿瘤可见表面血管,颜色灰白,质地较硬。光镜下见,对照组肿瘤具有恶性肿瘤细胞的一般特性,还具有特征性的腺腔样结构。实验组见不同程度点、片状坏死,并有炎性细胞的浸润,以联合用药组最重。免疫组织化学法检测Caspase-3的变化,对照组、4-HPR组、顺铂组、联合用药组,结果用免疫组化评分(HIS)分别为:2.78±1.33、4.15±0.76、5.22±0.62、6.37±1.25,各组与对照组相比,联合用药组与单药组相比,差异均有统计学意义(p<0.05)。流式细胞术结果显示:对照组、4-HPR组、顺铂组、联合用药组,细胞凋亡率逐渐升高,分别为6.43±2.31%、14.75±4.32%、21.54±1.47%、25.76±3.42%,细胞周期Go/G1期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多,S期细胞变化不明显。结论:4-HPR对SKVO-3细胞的增殖抑制作用呈时间-剂量依赖关系,4-HPR与顺铂联合应用可增强顺铂对SKVO-3细胞的增殖抑制作用。4-HPR可抑制SKVO-3细胞裸鼠移植瘤的生长,4-HPR与顺铂联合应用抑瘤效果增强。4-HPR可使SKVO-3细胞,细胞周期阻滞于G2/M期,诱导其凋亡,4-HPR与顺铂联合应用诱导SKVO-3细胞凋亡作用增强。4-HPR可通过增加Caspase-3蛋白的表达,增强SKVO-3细胞对顺铂的敏感性。
姬立芹,王芝琴,郝艳华[9](2012)在《VEGF-C反义寡核苷酸和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞SKOV3生长、粘附、侵袭能力的抑制作用》文中研究指明目的探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C ASODN)和姜黄素联合化疗对人卵巢癌细胞SKOV3生长粘附侵袭能力的抑制作用。方法 MTT法检测VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞的增殖抑制效应;MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质粘附能力,体外侵袭实验检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力。结果 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞有明显的增殖抑制作用,使卵巢癌细胞对细胞外基质粘附率明显降低,穿透重组基质膜数目明显下降。结论 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗能明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的生长粘附侵袭能力,可望为卵巢癌提供一种有效的联合化疗方法。
张秀梅[10](2012)在《姜黄素对紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞survivin、Bcl-2表达的影响》文中指出研究目的:检测姜黄素对紫杉醇诱导的人卵巢癌SKOV-3, A2780细胞中survivin、 Bcl-2蛋白表达水平的影响及细胞存活率的变化,探究姜黄素对紫杉醇化疗增敏的可能作用机制及与TLR4/MyD88的关系。研究方法:采用ELISA法检测细胞中survivin、 Bcl-2的表达,Bradford法检测总蛋白的表达,按pg/mg蛋白表示两种目标蛋白的表达水平;MTT法检测药物对人卵巢癌细胞生长抑制作用。研究结果:1、紫杉醇和脂多糖能够以时间和浓度依赖的方式促进SKOV-3细胞survivin、 Bcl-2的表达,而紫杉醇能够下调A2780细胞中两种目标蛋白的表达,脂多糖却无此作用;姜黄素在低浓度时并不影响两种目标蛋白在两种细胞株的表达,高浓度则明显下调;低浓度的姜黄素无论与紫杉醇或脂多糖联合作用,均不影响Bcl-2在两种细胞中的表达水平,但却能明显下调survivin的表达水平,而高浓度的姜黄素与紫杉醇联合后能够明显下调survivin、 Bcl-2的表达;2、姜黄素和紫杉醇均以浓度依赖的方式抑制SKOV-3和A2780细胞的增殖,两者联合作后起协同作用,能够明显增强紫杉醇的细胞毒作用,IC50较单独用药时明显下降。研究结论:紫杉醇-TLR4/MyD88+-survivin/Bcl-2途径存在于MyD88十的人卵巢癌细胞,且能够被紫杉醇或脂多糖激活,促进survivin/Bcl-2的过表达,姜黄素能够以时间和浓度依赖的方式下调卵巢癌细胞两种蛋白的表达,且在耐药的MyD88+的卵巢癌细胞株中更为明显。姜黄素能够抑制卵巢癌细胞的增殖,与紫杉醇联合运用后以不依赖TLR4/MyD88+途径实现其对紫杉醇的化疗增敏作用。
二、姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用(论文提纲范文)
(1)多功能纳米超声微泡的制备、表征及其靶向治疗卵巢癌的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略语名词对照表 |
前言 |
参考文献 |
综述 声动力治疗的研究进展 |
参考文献 |
第一章 纳米超声微泡CD44-NBs的制备及表征 |
前言 |
1.实验材料 |
1.1 试剂 |
1.2 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 CD44-NBs的制备 |
2.1.1 CD44-PEG_(2000)-DSPE的制备 |
2.1.2 CD44-NBs的制备 |
2.2 CD44-NBs的表征 |
2.2.1 TEM检测 |
2.2.2 CD44-NBs水合粒径及电位检测 |
2.2.3 CD44-NBs显微镜观察 |
2.2.4 CD44-NBs中姜黄素的包封率、载药量测定 |
2.2.5 CD44-NBs中全氟己烷包裹量测定 |
2.2.6 CD44-NBs稳定性检测 |
2.2.7 CD44-NBs声致相变检测 |
2.2.7.1 TEM检测 |
2.2.7.2 水合粒径及电位检测 |
2.2.7.3 CD44-NBs显微镜观察 |
2.2.8 CD44-NBs热致相变检测 |
2.2.9 CD44-NBs释药特性的检测 |
2.3 统计学方法 |
3.实验结果 |
3.1 CD44-NBs的形貌及粒径分析 |
3.2 CD44-NBs中姜黄素的包封率、载药量测定 |
3.3 CD44-NBs中全氟己烷包裹量测定 |
3.4 CD44-NBs稳定性检测 |
3.5 CD44-NBs声致相变检测 |
3.6 CD44-NBs热致相变检测 |
3.7 CD44-NBs释药特性的检测 |
4.讨论 |
5.结论 |
参考文献 |
第二章 纳米超声微泡CD44-NBs的体内外靶向评价 |
前言 |
1.实验材料 |
1.1 细胞和动物 |
1.2 试剂 |
1.3 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 细胞培养 |
2.1.1 卵巢癌细胞的复苏 |
2.1.2 卵巢癌细胞的传代 |
2.1.3 卵巢癌细胞的冻存 |
2.2 人卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2 细胞CD44 阳性率的表达 |
2.3 卵巢癌组织标本CD44 阳性率检测 |
2.4 傅里叶红外光谱仪检测CD44的偶联 |
2.5 纳米微泡的制备 |
2.5.1 NBs的制备 |
2.5.2 CD44@Dir-NBs的制备 |
2.6 CD44-NBs体外细胞靶向性评价 |
2.6.1 流式细胞仪检测 |
2.6.2 激光共聚焦检测 |
2.7 CD44-NBs体内靶向性评价 |
2.7.1 卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型的构建 |
2.7.2 近红外活体成像 |
2.8 CD44-NBs超声成像 |
2.8.1 NBs体外超声成像 |
2.8.2 CD44-NBs体内超声成像 |
2.9 统计学方法 |
3.实验结果 |
3.1 人卵巢癌细胞株SKOV3和ES-2 细胞CD44 阳性率的表达 |
3.2 卵巢组织中CD44 表达与临床病理特征之间的关系 |
3.3 FTIR检测CD44 的偶联情况 |
3.4 CD44-NBs体外细胞靶向性评价 |
3.4.1 流式细胞仪检测 |
3.4.2 激光共聚焦检测 |
3.5 近红外活体成像 |
3.6 CD44-NBs超声成像 |
3.6.1 体外超声成像 |
3.6.2 体内超声成像 |
4.讨论 |
5.结论 |
参考文献 |
第三章 纳米超声微泡CD44-NBs靶向治疗卵巢癌的实验研究 |
前言 |
1.实验材料 |
1.1 细胞和动物 |
1.2 试剂 |
1.3 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 CD44-NBs体外安全性评价 |
2.1.1 卵巢癌细胞培养 |
2.1.2 姜黄素浓度对卵巢癌细胞的影响 |
2.1.3 超声辐照时间对卵巢癌细胞的影响 |
2.1.3.1 超声辐照时间对卵巢癌细胞增殖的影响 |
2.1.3.2 超声辐照时间对溶液温度的影响 |
2.1.4 CD44-NBs浓度对卵巢癌细胞的影响 |
2.2 CD44-NBs体内安全性评价 |
2.2.1 血生化结果检测 |
2.2.2 体重及组织病理观察 |
2.3 CCK-8 检测CD44-NBs的体外治疗作用 |
2.4 CD44-NBs的体内治疗作用 |
2.4.1 肿瘤生长情况、体积和裸鼠体重观察 |
2.4.2 病理切片观察 |
2.4.3 荷瘤鼠生存期观察 |
2.5 统计学方法 |
3.实验结果 |
3.1 CD44-NBs体外安全性评价 |
3.2 CD44-NBs体内安全性评价 |
3.3 CD44-NBs的体外治疗作用 |
3.4 CD44-NBs的体内治疗作用 |
4.讨论 |
5.结论 |
参考文献 |
第四章 纳米超声微泡CD44-NBs靶向治疗卵巢癌的杀伤机制研究 |
前言 |
1.实验材料 |
1.1 细胞和动物 |
1.2 试剂 |
1.3 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 卵巢癌细胞培养 |
2.2 材料~1O_2检测 |
2.3 细胞活性氧检测 |
2.4 CD44-NBs对卵巢癌细胞生物学行为及相关机制研究 |
2.4.1 平板克隆形成实验 |
2.4.2 划痕迁移实验 |
2.4.3 侵袭实验 |
2.4.4 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) |
2.4.5 Western blot检测 |
2.5 统计学方法 |
3.实验结果 |
3.1 材料~1O_2检测 |
3.2 细胞活性氧检测 |
3.3 CD44-NBs对卵巢癌细胞生物学行为的影响 |
3.4 声动力治疗的相关机制研究 |
4.讨论 |
5.结论 |
参考文献 |
全文总结与展望 |
致谢 |
作者简介 |
(2)苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究(论文提纲范文)
中英文缩略词对照表 |
第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
参考文献 |
攻读博士学位期间文章发表情况 |
致谢 |
(3)鳄胆素诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究(论文提纲范文)
主要缩略语表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
1 前言 |
1.1 卵巢癌研究状况 |
1.1.1 卵巢癌的治疗 |
1.1.2 卵巢癌的分类 |
1.1.3 卵巢癌的诊断 |
1.1.4 卵巢癌的诱因及分子生物学机制 |
1.2 天然抗肿瘤药物的研究状况 |
1.2.1 植物来源抗肿瘤药物 |
1.2.2 动物来源抗肿瘤药物 |
1.2.3 微生物来源抗肿瘤药物 |
1.2.4 新型抗肿瘤药物及方式 |
1.3 鳄鱼 |
1.3.1 鳄鱼血的开发研究进展 |
1.3.2 鳄鱼油烫伤膏的开发研究 |
1.4 动物胆汁 |
1.4.1 胆汁酸 |
1.4.2 胆汁的药用价值 |
1.5 细胞周期 |
1.5.1 细胞周期的概念 |
1.5.2 细胞周期的调控 |
1.5.3 细胞周期调控相关因子 |
1.6 细胞凋亡通路及具体机制 |
1.6.1 Notch信号通路及研究进展 |
1.6.2 Wnt信号通路及研究进展 |
1.7 本论文的研究内容及意义 |
1.7.1 论文研究内容 |
1.7.2 研究意义 |
2 实验试剂与仪器 |
2.1 主要材料和试剂 |
2.2 主要实验仪器 |
3 实验方法 |
3.1 鳄胆素的提取 |
3.2 卵巢癌细胞的培养 |
3.3 MTT实验法测量细胞的增值率 |
3.4 CCK-8实验 |
3.5 集落形成实验 |
3.6 普通光学相差显微镜下观察细胞形态 |
3.7 荧光显微镜下细胞形态的观察 |
3.8 检测细胞周期的变化 |
3.9 双染流式细胞术定置栓测鳄胆素处理之后细胞的凋亡率 |
3.10 Western blotting |
3.10.1 总蛋白的提取 |
3.10.2 配胶 |
3.10.3 电泳 |
3.10.4 电转 |
3.10.5 封闭 |
3.10.6 一抗孵育 |
3.10.7 二抗孵育 |
3.10.8 显影 |
3.11 BALB/c裸鼠体外移植瘤模型的构建 |
3.12 肿瘤及脏器组织染色(苏木精-伊红染色法) |
3.13 肿瘤组织蛋白的提取 |
3.14 数据分析 |
4 实验结果 |
4.1 MTT法初筛癌细胞对鳄胆素的敏感程度 |
4.2 鳄胆素对人卵巢癌A2780细胞的抑制作用 |
4.3 鳄胆素对人卵巢癌A2780细胞形态的影响 |
4.3.1 光镜显微镜下观察鳄胆素对A2780细胞形态学的影响 |
4.3.2 倒置荧光显微镜下观察鳄胆素对A2780细胞形态学的影响 |
4.4 鳄胆素对人卵巢癌A2780细胞集落形成能力的影响 |
4.5 鳄胆素对人卵巢癌A2780细胞周期分布的影响 |
4.6 Annexin V/PI双染法定量检测鳄胆素对人卵巢癌A2780的凋亡诱导效果 |
4.7 鳄胆素对人卵巢癌SKOV-3细胞的抑制作用 |
4.8 倒置荧光显微镜下观察鳄胆素对A2780细胞形态学的影响 |
4.9 鳄胆素对人卵巢癌SKOV-3细胞周期分布的影响 |
4.10 鳄胆素对卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡率的检测 |
4.11 鳄胆素对卵巢癌SKOV-3细胞克隆形成能力的影响 |
4.12 鳄胆素对Bax、Bcl-2和P53蛋白表达量影响 |
4.13 鳄胆素对Notch信号通路中蛋白表达量影响 |
4.14 鳄胆素对Wnt信号通路中蛋白表达量影响 |
4.15 鳄胆素联合常见化疗药物对卵巢癌A2780细胞的抑制作用 |
4.15.1 鳄胆素联合阿霉素 |
4.15.2 鳄胆素联合多西紫杉醇 |
4.15.3 鳄胆素联合吉西他滨 |
4.15.4 鳄胆素联合姜黄素 |
4.15.5 鳄胆素联合卡铂 |
4.15.6 鳄胆素联合顺铂 |
4.15.7 鳄胆素联合奈达铂 |
4.15.8 鳄胆素联合5-氟尿嘧啶 |
4.16 鳄胆素对BALB/c裸鼠体重和肿瘤生长的影响 |
4.17 鳄胆素对肿瘤组织的病理形态学影响 |
4.18 鳄胆素对裸鼠脏器病理形态学的影响 |
4.19 鳄胆素对Bax、Bcl-2和P53蛋白表达量的影响 |
4.20 鳄胆素鳄胆素对Notch通路蛋白表达量的影响 |
4.21 鳄胆素对Wnt通路关键蛋白表达量的影响 |
4.22 鳄胆素对VEGF和PCNA蛋白表达量的影响 |
5 讨论 |
5.1 鳄胆素对卵巢癌细胞生长的抑制作用 |
5.2 鳄胆素诱导卵巢癌细胞发生凋亡 |
5.3 鳄胆素诱导卵巢癌A2780细胞发生凋亡的信号通路 |
5.4 鳄胆素和常见化疗药物的联合作用 |
5.5 鳄胆素对人卵巢癌A2780细胞BALB/c裸鼠移植瘤模型的影响 |
6 结论 |
7 展望 |
8 参考文献 |
在读期间发表学术论文 |
在读期间获得荣誉 |
致谢 |
(4)新型姜黄素类似物L50H8体内外抗卵巢癌作用的研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一部分 体外二维静态细胞培养模式实验 |
引言 |
1 材料和方法 |
1.1 材料和试剂 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 二维静态细胞培养模式下L50H8 抑制SKOV3和OVCAR3 细胞的增殖 |
2.2 二维静态细胞培养模式下L50H8对SKOV3和OVCAR3 细胞周期的影响 |
2.3 二维静态细胞培养模式下L50H8对SKOV3和OVCAR3 细胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的 mRNA及蛋白表达的影响 |
2.4 二维静态细胞培养模式下L50H8对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
2.5 二维静态细胞培养模式下L50H8对卵巢癌细胞中凋亡调控相关蛋白表达的影响 |
2.6 二维静态细胞培养模式下L50H8 对卵巢癌细胞中ERS相关蛋白GRP78 和CHOP表达的影响 |
2.7 二维静态细胞培养模式下L50H8对卵巢细胞侵袭能力及侵袭转移相关蛋白CD147、MMP2、MMP9、VEGF表达的影响 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二部分 体外三维动态细胞培养模式实验 |
引言 |
1 材料和方法 |
1.1 材料和试剂 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
2.1 三维动态细胞培养模式下L50H8抑制卵巢癌细胞的增殖 |
2.2 三维动态细胞培养模式下L50H8对卵巢癌细胞周期的影响 |
2.3 三维动态细胞培养模式下L50H8 对卵巢癌细胞Cyclin A和 Cyclin B的 mRNA和蛋白表达的影响 |
2.4 三维动态细胞培养模式下L50H8对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
2.5 三维动态细胞培养模式下L50H8对卵巢癌细胞中凋亡调控相关蛋白Bax、caspase8、cleaved-caspase3及AIF表达的影响 |
2.6 三维动态细胞培养模式下L50H8 对卵巢癌细胞中ERS相关蛋白GRP78 和CHOP表达的影响 |
2.7 三维动态细胞培养模式下L50H8 对卵巢癌细胞CD147、MMP2、MMP9、VEGF表达的影响 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 体内实验 |
引言 |
1 材料和方法 |
1.1 材料和试剂 |
1.2 实验方法 |
2 结果 |
3.1 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤生长的影响 |
3.2 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响 |
3.3 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤组织周期蛋白Cyclin A和CyclinB表达的影响 |
3.4 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤组织凋亡调控蛋白Bax、caspase8、cleaved-caspase3及AIF表达的影响 |
3.5 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤组织ERS相关蛋白GRP78和CHOP表达的影响 |
3.6 L50H8对Balb/C裸鼠移植瘤组织侵袭转移相关蛋白CD147、MMP2、MMP9、VEGF表达的影响表达的影响 |
3.7 L50H8对Balb/C裸鼠心脏、肝、肾组织的影响 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
(6)化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
研究背景 |
一、EOC 的生物标志物 |
二、筛查策略 |
三、治疗 |
四、小结与展望 |
参考文献 |
第一部分 DDP 联合 CIK 细胞对卵巢癌细胞株 SKOV-3 的杀伤效应 |
第一章 材料与方法 |
第二章 结果 |
第三章 讨论 |
第四章 结论 |
参考文献 |
第二部分 氟尿嘧啶联合 CIK 细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究 |
第一章 材料和方法 |
第二章 结果 |
第三章 讨论 |
第四章 结论 |
参考文献 |
第三部分 化疗联合 CIK 细胞治疗卵巢癌的临床观察 |
第一章 资料与方法 |
第二章 临床病例资料结果 |
第三章 讨论 |
第四章 结论 |
参考文献 |
综述一:CIK 细胞过继免疫治疗研究进展 |
参考文献 |
综述二:协同刺激分子 B7-H4 在卵巢癌中的研究进展 |
参考文献 |
综述三:miRNA 与卵巢癌 |
参考文献 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
本研究所获的基金资助 |
中英文缩略词表 |
致谢 |
(7)miRNA-519d、双联苄化合物DHA2对卵巢癌的生长抑制作用及其机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 miR-519d通过靶向调控XIAP抑制卵巢癌细胞增殖及增强顺铂敏感性的研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图表 |
参考文献 |
第二部分 双联苄化合物DHA2通过调控XIAP及AKT/mTOR信号通路抑制卵巢癌作用机制的研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
附图表 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文 |
英文文章 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
(8)4-HPR联合DDP对卵巢癌细胞株SKOV3增殖抑制作用的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一部分 4-HPR联合DDP对卵巢癌细胞株增殖抑制作用的体外实验研究 |
前言 |
材料与方法 |
实验结果 |
结论 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 4-HPR联合DDP对卵巢癌移植瘤增殖抑制作用的体内实验研究 |
前言 |
材料和方法 |
实验结果 |
结论 |
讨论 |
参考文献 |
论文图表 |
综述1 |
参考文献 |
综述2 |
参考文献 |
综述3 |
参考文献 |
缩略词表 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
致谢 |
(9)VEGF-C反义寡核苷酸和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞SKOV3生长、粘附、侵袭能力的抑制作用(论文提纲范文)
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
1.2.1 细胞培养 |
1.2.2 MTT法测定药物对细胞的生长抑制率 |
1.2.3 粘附实验 |
1.2.4 侵袭实验 |
1.2.5 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 VEGF-C ASODN和姜黄素分别单独用药对卵巢癌细胞增殖的影响 |
2.2 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞粘附能力的影响 |
2.3 VEGF-C ASODN和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞侵袭能力的影响 |
3 讨论 |
(10)姜黄素对紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞survivin、Bcl-2表达的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩写词对照表 |
1. 引言 |
2. 正文 |
2.1 材料 |
2.1.1 细胞株 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要实验仪器 |
2.1.4 主要实验试剂的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 实验流程图 |
2.2.2 细胞培养、传代、接种 |
2.2.3 药物配制 |
2.2.4 药物诱导 |
2.2.5 药物对SKOV-3、A2780细胞的生长抑制情况 |
2.2.6 统计学分析方法 |
2.3 结果 |
2.3.1 药物诱导SKOV-3、A2780细胞后survivin、Bcl-2的表达 |
2.3.2 紫杉醇、LPS、姜黄素作用不同时间后survivin、Bcl-2的表达 |
2.3.3 紫杉醇或LPS与姜黄素联合作用SKOV-3、A2780细胞48小时后survivin、Bcl-2的表达 |
2.3.4 药物对SKOV-3、A2780细胞的生长抑制情况 |
2.4 讨论 |
2.4.1 TLR4/MyD88+与紫杉醇耐药 |
2.4.2 Survivin/Bcl-2与紫杉醇耐药 |
2.4.3 姜黄素抑制卵巢癌紫杉醇耐药 |
2.4.4 问题和展望 |
3. 结论 |
致谢 |
参考文献 |
文献综述 |
1. 姜黄素来源及结构 |
2. 姜黄素抗肿瘤作用机制 |
3. 前景与展望 |
参考文献 |
附录一 (在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果) |
四、姜黄素及其联合化疗对卵巢癌细胞株3AO体外增殖的抑制作用(论文参考文献)
- [1]多功能纳米超声微泡的制备、表征及其靶向治疗卵巢癌的实验研究[D]. 王曦辉. 东南大学, 2020
- [2]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [3]鳄胆素诱导卵巢癌细胞凋亡的机制研究[D]. 付启瑞. 厦门大学, 2019(08)
- [4]新型姜黄素类似物L50H8体内外抗卵巢癌作用的研究[D]. 邱扬. 暨南大学, 2019(03)
- [5]姜黄素单独及联合顺铂对人卵巢癌细胞株3AO,SKOV3增殖及其对Notch1,Hes1信号表达的影响[J]. 相萌,刘棣. 陕西医学杂志, 2014(09)
- [6]化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察[D]. 徐梅. 苏州大学, 2014(04)
- [7]miRNA-519d、双联苄化合物DHA2对卵巢癌的生长抑制作用及其机制研究[D]. 庞迎新. 山东大学, 2014(12)
- [8]4-HPR联合DDP对卵巢癌细胞株SKOV3增殖抑制作用的实验研究[D]. 尹凤玲. 苏州大学, 2013(05)
- [9]VEGF-C反义寡核苷酸和姜黄素联合化疗对卵巢癌细胞SKOV3生长、粘附、侵袭能力的抑制作用[J]. 姬立芹,王芝琴,郝艳华. 现代医院, 2012(08)
- [10]姜黄素对紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞survivin、Bcl-2表达的影响[D]. 张秀梅. 成都中医药大学, 2012(04)