一、利巴韦林制剂的应用和定量分析方法概述（论文文献综述）
徐令东[1]（2021）在《戊肝病毒新型复制子细胞系及沙鼠感染模型的建立与应用》文中认为戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是引起急慢性肝炎的主要病原之一,在世界范围内每年造成约5万人死亡。戊型肝炎在孕妇中的致死率高达25%,并且HEV在器官移植病人和免疫缺陷患者中会发生持续性感染。限制HEV研究的主要因素是缺乏有效的体外培养体系和持续感染的小动物模型。本研究建立了稳定表达绿色荧光蛋白的p6-EGFP/Zeocin（p6-EZ）HEV复制子细胞系和基因3型人源HEV蒙古长爪沙鼠感染模型。目前,HEV缺乏良好的细胞培养系统,因此需要建立病毒复制子细胞模型来模拟HEV在细胞中的持续性感染,并利用该模型研究HEV发病的分子机制等。本研究建立了基因3型HEV RNA复制子细胞模型,在HEV复制子细胞模型中含有表达EGFPZeocin（EZ）基因的HEV RNA复制子。通过将体外转录获得的HEV复制子RNA转染至细胞中,在Zeocin抗生素筛选下,HEV复制子可以在人类肝癌细胞（Huh-7-S10-3）或仓鼠鼠肾细胞（BHK-21）中持续自我复制。在Zeocin抗生素筛选下,S10-3-EZ和BHK-21-EZ两个细胞系可以连续传代并稳定表达HEV复制子p6-EZ。实验结果显示,HEV的基因组、亚基因组RNA和非结构蛋白ORF1均在HEV复制子细胞中稳定表达。利用HEV复制子细胞模型,本研究证明HEV感染能够抑制I型干扰素通路的激活,表现为降低IRF3磷酸化的水平,表明HEV的持续性感染会抑制细胞天然免疫的应答。本研究进一步证明,干扰素（IFN-α）或利巴韦林可以显着降低复制子细胞系中HEV RNA的拷贝数,且呈剂量依赖性。以上结果进一步证明该细胞模型在研究HEV抗病毒药物和HEV与Ⅰ型IFN信号通路互作中的应用价值。接下来本研究建立了人基因3型戊型肝炎病毒沙鼠感染模型,并对基因1型和4型戊型肝炎病毒感染沙鼠进行了回顾性研究。并进一步证实HEV沙鼠感染模型在抗病毒药物药效评价、天然免疫RNA识别和病毒与Ⅰ型IFN信号通路互作研究中的应用价值。本研究分别通过肝内接种“加帽”全长HEV RNA、灌胃接种HEV活病毒或腹腔接种HEV活病毒的方式对沙鼠进行感染。在沙鼠肝脏、胆汁和脾脏中均检测到了HEV RNA的存在,病毒感染持续时间长达7周,检测到HEV感染导致沙鼠肝脏损伤,并在血清中检测到HEV-IgG抗体。本研究利用HEV沙鼠感染模型对PEG-IFNα-2a和利巴韦林治疗HEV感染的有效性进行了评价。同时利用HEV沙鼠感染模型检测了模式识别受体-干扰素系统通路（PRR-interferon signaling）在体内对病毒复制的影响。当使用两种靶向抑制TBK1的小分子药物（BX795和MRT67307）时,HEV在沙鼠中的复制明显增强。该动物模型的建立将促进HEV特异性抗病毒药物和体内HEV感染与宿主天然免疫互作机制的研究。最后,本研究利用HEV复制子细胞系对小分子抑制剂库进行筛选,发现小分子抑制剂库中17种HSP90的抑制剂均能有效抑制HEV的复制,其疗效显着优于传统抗病毒药物。HSP90小分子抑制剂使ORF1从ORF1-HSP90复合物中释放出来,并迅速降解。实验结果表明,靶向抑制ORF1-HSP90相互作用的治疗HEV感染策略是安全有效的,并且减轻了HEV感染引起的沙鼠肝损伤。本研究建立了基因3型HEV复制子细胞系统和沙鼠感染模型,发现HSP90是支持HEV复制的关键宿主因子,并提出了一种可行的HEV治疗策略。有助于HEV持续性感染分子机制及抗HEV药物的进一步研究。
李楠[2]（2021）在《质谱法检测禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的研究》文中研究指明本文按照60 mg/kg.b.w.d的给药剂量饲喂样品白羽鸡利巴韦林和金刚烷胺。优化条件下检测,当金刚烷胺与利巴韦林的质量浓度处于0.50～200μg/L的区间内时呈现线性关系。经取样检测,得到鸡组织中的利巴韦林以及金刚烷胺的消除曲线,分析得出利巴韦林以及金刚烷胺在鸡组织中的消除规律如下:（1）利巴韦林和金刚烷胺在不同的鸡组织在休药前期的残留量均与给药剂量成正比。停止服用药物后的4 h,不同组织中的利巴韦林和金刚烷胺的残留量均达峰值,相较其他组织,肾脏组织中药物残留量更高。（2）在停止服用药物后,相较于鸡胸肉组织而言,肝脏以及肾脏中的金刚烷胺的留存时间更长;同时给药剂量与利巴韦林在组织中的残留量无相关性,停药后迅速代谢完全。使用高分辨质谱对鸡肉及其肝脏、肾脏组织中利巴韦林和金刚烷胺残留进行测定,研究其代谢规律并对其残留检测方法进行探究。正离子的情况下,利巴韦林与金刚烷胺有较高响应值,实验采用正离子全扫描。使用体积比为1%的三氟乙酸-甲醇溶液提取鸡组织样品,通过Qu ECh ERS方法、PCX固相萃取柱进行净化,使用内标法定量检测,结果显示在0.50～200μg/L的范围内,金刚烷胺与利巴韦林有良好线性关系。检出两种目标分析物的限度分别为0.30μg/kg以及0.15μg/kg,两种药物的定量下限的值分别为1.00μg/kg与0.50μg/kg,样品的RSD范围处于6.0%-10.7%的范围内。在优化色谱、质谱条件下能够在洗脱液、流动相以及固相萃取柱等方面开展实验,最后以水和空白鸡肉、肝脏、肾脏基质为阴性样品,添加目标化合物经Q-TOF质谱技术筛查分析验证:被测物质通过QTOF质谱法能够获得一定能量使其能够基于一定的规律分裂为碎片状带电粒子,通过这一方式,检测器能够对相关离子的质核比进行计算,同时基于相应的顺序绘制相应的质谱图。比对检测结果,提取疑似靶药代谢物的精确分子量,通过标志性代谢产物为综合评价药物残留提供数据支持。
王上[3]（2021）在《基于自噬途径研究小柴胡汤对甲型流行性感冒的干预作用》文中提出背景甲型流感病毒是一种具有高度传染性和致病性的病毒,且具有高突变性,流感易苗易于失效且抗病毒药物治疗具有一定局限性。因此,以宿主因素为靶点的治疗手段成为抗流感病毒新兴疗法和未来趋势,而这一转变正是中医邪正关系的体现,也正是中医治疗的优势所在。细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。甲型流感病毒可以诱导自噬体的大量堆积并阻止自噬体与溶酶体的融合,从而导致自噬流的不顺畅。而自噬流的不顺畅恰好与伤寒少阳枢机不利非常相似。因此,基于这个层面,针对少阳枢机不利,选用少阳方（如小柴胡汤）,将可能促进有效自噬流的完成,从而截断病情的深入,防止肺炎的发生。小柴胡汤是《伤寒论》少阳病的主方,也是扶正祛邪的代表方,已有研究报道,小柴胡汤具有明显的抗流感病毒作用,同时能提高机体免疫力和降低炎性反应。而对于小柴胡汤调节自噬的作用却鲜为报道。因此,本研究从科学计量学、理论研究、网络药理学和实验研究四个方面对小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的疗效、作用机制及配伍意义进行初步探讨,以期为防治病毒感染性疾病用药靶点提供新的思路。目的1.运用科学计量学方法（citespace）对流感研究现状及前沿热点进行分析并挖掘流感与自噬共同作用通路,预测未来研究趋势。2.通过溯源少阳本义,结合《伤寒论》原文,从少阳病病机演变、小柴胡汤方证、小柴胡汤中药药理学谱等方面阐述小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的理论及临床依据。3.对小柴胡汤治疗流行性感冒的网络药理学研究,从“中药-成分-靶点-通路”的层面预测其主要作用机制,及体现药物配伍意义的主要通路。4.结合组方原则及网药结果,研究小柴胡汤及拆方对H1N1流感病毒的体外抑制作用,其机制是否与自噬相关,并阐释其配伍意义。方法1.以“流行性感冒”为研究主题,运用citespace软件,检索Web of Science（Wo S）数据库的2005-2020年文献,将结果从关键词共现、关键词聚类、关键词突现、双图叠加等四个方面进行可视化分析。2.筛选小柴胡汤有效成分并对应靶点基因,并检索流感疾病靶点。应用Cytoscape3.2.6软件构建小柴胡汤-流感-靶点-通路网络,筛选核心靶点基因,进行GO功能和KEGG富集分析,预测主要作用机制及复方配伍意义主要通路。3.制备小柴胡汤及拆方的水提醇沉提取液、颗粒剂及含药血清三种制剂,分别对人A549、狗肾细胞（MDCK）两种细胞系进行细胞毒性测定和神经氨酸酶活性测定,筛选最优制备方案和最适细胞系。4.基于最适细胞系和小柴胡汤及拆方最适制备方案,运用免疫印迹法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、m TOR及磷酸化、beclin蛋白表达表达,探讨小柴胡汤及拆方对流感病毒诱导自噬的调控及作用机制,并阐释并配伍意义。结果1.共纳入流感机制文献7223篇,关键词聚类主要分为流感致病性和发病机制研究;宿主免疫应答及炎性反应研究;抗流感药物及疫苗的研究。流行性感冒机制研究与细胞自噬研究领域共同的关键词为自噬、复制、感染、凋亡、NF-κB、天然免疫反应等。2.小柴胡汤成分靶点与流感疾病靶点共有51个靶点,其主要成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素、β-谷甾醇、二甲氧基黄酮、人参皂苷Rh2、蓝堇碱、叶含长管贝壳杉素A九种,其核心基因为VEGFA、AKT1、IL6、TNF、MMP9、JUN、IL10、IL18等十个,其富集分析多与炎症反应、各种代谢相关。3.在MDCK细胞中,小柴胡汤及核心拆方水提液的抗病毒选择指数均为1左右;小鼠血清在体外（细胞）抗病毒实验中表现出极强的抗流感病毒活性,选择指数为128.2以上;小柴胡汤、柴-芩-参颗粒剂的抗病毒选择指数均为1左右,柴-芩颗粒剂的抗病毒选择指数为2,具有一定的抗病毒效力。此外,小柴胡汤及拆方颗粒剂对人A549细胞的存活率整体不高,尤其是柴-芩颗粒剂低浓度对A549细胞即显示一定毒性,存活率<85%。在神经氨酸酶抑制活性检测中显示,小柴胡汤及拆方颗粒剂对H1N1流感病毒没有抑制作用,无SI。4.病毒感染组与空白对照组相比,LC3-Ⅱ蛋白表达水平显着升高（P<0.01）。小柴胡汤及拆方颗粒剂与病毒感染对照组相比,有下调LC3-Ⅱ蛋白表达的作用（P<0.01）,尤以小柴胡汤组最为明显。与病毒感染组相比,小柴胡汤及拆方颗粒剂均有上调p62蛋白表达的作用,其中,柴-芩组最为明显（P<0.01）,柴-芩-参组次之（P<0.05）,小柴胡汤最次。小柴胡汤及拆方三组与病毒感染组相比,有上调p-m TOR蛋白水平表达的趋势（P>0.05）,其中柴-芩组上调作用最为明显。小柴胡汤组与病毒感染组相比,下调beclin-1蛋白表达最为明显（P<0.05）,柴-芩-参组下调作用最次,无统计学差异（P>0.05）。结论1.科学计量学及理论研究表明,流感的发生发展以及严重程度与病毒和宿主的相互关系密不可分。以宿主为靶点的治疗手段是该领域研究的重要转变,而这一转变正体现了中医扶正祛邪的治疗特色。细胞自噬是流感病毒与宿主之间相互作用的重要机制之一。在中医看来,甲流病毒导致自噬流的不顺畅与伤寒少阳枢机不利非常相似,这也正与小柴胡汤方证相合。2.网络药理学结果可知,小柴胡汤可调节神经-免疫-炎症反应,治疗甲型流行性感冒,其主要机制与柴胡、黄芩、人参三味药相关。3.实验结果可知,从抑制甲型H1N1神经氨酸酶活性而言,仅柴胡-黄芩表现出一定抑制作用,体现了其祛邪之功。小柴胡汤无抑制NA活性作用,但在自噬调节上作用明显,且在下调LC3-Ⅱ/LC3-I表达及抑制Beclin-1蛋白水平方面更为突出,其机制可能与Beclin-1相关,而同样具有扶正祛邪之意的柴胡-黄芩-人参组却有差异,提示夏、姜、枣、草四味药可能在配伍中发挥着促进自噬降解的作用。此外,鉴于小柴胡汤本身不能抑制NA活性,说明小柴胡汤的作用靶点可能不直接作用于病毒,可能主要在宿主因素,与调节自噬、促进自噬代谢途径有关。因此,小柴胡汤对自噬的调节作用,从某种意义上讲,拓展了小柴胡汤临床运用的新思路,也在一定程度上揭示了小柴胡汤扶正祛邪的作用机制与药物君臣佐使配伍的意义,为今后进一步深入研究奠定基础。
张青青[4]（2021）在《利巴韦林调节PRMT1和PRMT5抑制软组织肉瘤生长的作用及机制》文中指出背景:软组织肉瘤（Soft tissue sarcomas,STS）是起源于间叶组织的恶性肿瘤。尽管近年来有一些新型化疗药应用于软组织肉瘤患者,但大部分晚期患者的临床获益仍非常有限,因此,探索软组织肉瘤诊治的新靶标和寻找高效低毒的靶向药物迫在眉睫。精氨酸甲基化是一种可发生于多种蛋白（如组蛋白和非组蛋白）的翻译后修饰现象,由蛋白精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferases,PRMTs）家族催化产生,PRMTs分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种亚型,有研究表明,PRMT1（Ⅰ型）和PRMT5（Ⅱ型）在多种肿瘤细胞中高表达,且与预后不良有关,可作为治疗癌症的理想靶标。然而,PRMT1和PRMT5在软组织肉瘤中的研究尚无文献报道。利巴韦林（Ribavirin,RIB）是一种广谱抗病毒药,主要用于丙型肝炎的治疗,已被证明具有一定的抗肿瘤作用,但其对于软组织肉瘤的作用及相关机制目前尚不明确。目的:研究RIB对软组织肉瘤细胞的体内外抗肿瘤活性,探索RIB在软组织肉瘤中与PRMT1及PRMT5的潜在调控关系,进而揭示RIB抗肿瘤作用的分子机制。方法:1.采用Western blot实验检测PRMT1和PRMT5在小鼠正常成纤维细胞L929和不同肉瘤细胞株（S180、HT-1080、A-673、U2OS和MG-63）中的表达情况,然后通过MTT实验检测RIB对上述细胞体外增殖的影响,进而分析RIB对不同肉瘤细胞的作用与PRMT1及PRMT5蛋白表达量的相关性。2.细胞水平:通过克隆形成实验和流式细胞术进一步考察RIB对软组织肉瘤细胞A-673和S180体外克隆、细胞周期和细胞凋亡的影响。3.动物实验:建立S180小鼠皮下移植瘤模型,考察RIB单用和与阿霉素（Doxorubicin,DOX）联用的体内抗肿瘤活性;建立S180小鼠肺转移模型,观察RIB对动物体内软组织肉瘤肺转移的影响;建立S180小鼠腹水瘤模型,观察RIB对早期和晚期S180腹水瘤模型小鼠生存期的影响,研究RIB对该模型小鼠腹膜通透性和免疫功能的影响。4.分子机制研究:采用qRT-PCR和Western blot检测RIB对软组织肉瘤细胞中PRMT1和PRMT5及其相应组蛋白靶标（H4R3me2a、H3R8me2s和H4R3me2s）的影响;采用ELISA实验检测RIB对S180腹水瘤模型小鼠腹水中血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）水平的影响;采用Ch IP实验分析RIB对PRMT1及PRMT5与VEGF相互作用的影响。结果:1.PRMT1和PRMT5蛋白表达水平分别在A-673和S180细胞中最高,在HT-1080和U2OS细胞中最低,MTT结果显示,RIB对A-673和S180细胞增殖具有显着的抑制作用,对HT-1080和U2OS细胞几乎无抑制作用,表明RIB对不同肉瘤细胞体外增殖的影响与PRMT1及PRMT5的蛋白表达水平呈正相关。2.RIB可显着抑制A-673克隆形成,诱导A-673和S180细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡,并且降低Cyclin D1和PCNA蛋白表达水平。3.在动物体内:RIB（100 mg/kg）单用可显着抑制S180小鼠皮下移植瘤的生长,抑瘤率为63.2%,DOX（2 mg/kg）单用抑瘤率为44.1%,而RIB与DOX联用时抑瘤率可高达78%,表明RIB可显着增强DOX的体内抗肿瘤活性。同时,RIB可抑制S180小鼠肺转移,延长早期和晚期S180腹水瘤模型小鼠生存期。除此之外,在S180小鼠腹水瘤模型中,RIB可降低小鼠腹膜通透性,提高小鼠胸腺指数和脾指数,增加脾脏淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+和CD19+）总数。4.在分子水平:RIB显着下调PRMT1和PRMT5的mRNA和蛋白水平,同时降低PRMT1和PRMT5特异性组蛋白靶标（H4R3me2a、H3R8me2s和H4R3me2s）的积累。ELISA结果显示,RIB显着降低小鼠腹水中VEGF的水平。此外,通过ChIP实验,我们发现RIB减少PRMT1而增加PRMT5在VEGF启动子区的富集,从而抑制VEGF的转录水平。结论:RIB可显着抑制软组织肉瘤的生长、转移并延长生存期,其作用主要与降低PRMT1和PRMT5表达、调节PRMT1/PRMT5在VEGF启动子区的富集抑制VEGF转录和提高机体免疫功能等有关。本研究为RIB的临床用药和药物研发提供了新的思路和理论依据。
田一贞[5]（2021）在《利巴韦林通过调节CARM1和PRMT5抑制肝癌生长的作用及机制研究》文中指出研究背景:精氨酸甲基化是一个普遍的翻译后修饰过程,与细胞发育和肿瘤发生有关。哺乳动物基因组编码九种精氨酸甲基转移酶（Protein arginine methyltransferases,PRMTs）催化精氨酸残基生成单甲基化精氨酸（Monomethylarginine,MMA）、对称二甲基化精氨酸（Symmetric dimethylarginine,SDMA）和非对称二甲基化精氨酸（Asymmetric dimethylarginine,ADMA）。其中PRMT4（又称为Coactivator-associated arginine methyltransferase 1,CARM1）属于Ⅰ型PRMTs,能催化产生ADMA;PRMT5（Protein arginine methyltransferase 5,PRMT5）属于Ⅱ型PRMTs,能催化产生SDMA。CARM1和PRMT5在多种癌症类型中异常高表达,已被证实与癌症发生有关,因此,CARM1和PRMT5可作为理想靶标用于肿瘤的治疗。通过使用CARM1/PRMT5特异性的小分子抑制剂,或者小干扰RNA,能够抑制众多肿瘤的生长。利巴韦林（Ribavirin,Rib）作为一种广谱抗病毒药,目前主要用于治疗丙型肝炎病毒感染。最近研究发现Rib能抑制胶质瘤和乳腺癌等的生长,但关于利巴韦林在肝癌中的作用及其表观调控机制目前尚无文献报道。目的:研究Rib对肝癌的体内外作用,以及Rib是否能通过调控CARM1和PRMT5抑制肝癌细胞生长,从而为肝癌患者临床治疗提供新的理论基础和治疗方案。方法:1、采用Western blot分析CARM1和PRMT5在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达谱;2、采用MTT和克隆实验,考察不同浓度Rib对HCC细胞体外增殖和克隆形成的影响;3、通过建立肝癌H22小鼠皮下移植瘤模型、人肝癌Hep G2裸鼠原位移植瘤模型和肝癌H22小鼠腹水瘤模型,观察Rib在动物体内对肿瘤生长和生存期影响;4、通过建立肝癌H22小鼠腹水瘤模型,检测分析Rib对小鼠腹膜通透性、腹水中VEGF含量和小鼠免疫功能的影响;5、采用Western blot和/或q RT-PCR分析Rib对CARM1和PRMT5表达水平,及其特异性组蛋白靶标H3R17me2a和H3R8me2s/H4R3me2s积累影响;6、采用Ch IP分析Rib对e IF4E和VEGF启动子区CARM1和H3R17me2a富集的影响。结果:1、Western blot分析结果显示,与正常肝细胞相比,CARM1在肝癌Hep G2、Bel-7402和H22中蛋白表达明显增高,PRMT5在肝癌Hep G2、Bel-7402和CBRH-7919中蛋白表达明显增高;2、MTT和克隆形成实验显示,Rib能够抑制HCC细胞增殖和克隆形成,且对CARM1和PRMT5高表达肝癌细胞,抑制细胞增殖作用明显增强;3、动物体内实验结果显示,Rib抑制皮下移植瘤和原位移植瘤生长,减少腹水生成,并延长小鼠生存期;4、在肝癌H22腹水瘤模型中,Rib能够降低小鼠腹膜通透性和腹水中VEGF水平。此外,Rib能够调节机体的免疫器官,与对照组比较,Rib组的胸腺指数和脾脏指数明显增加;5、RIB降低CARM1和PRMT5表达水平,及其特异性组蛋白靶标H3R17me2a和H3R8me2s/H4R3me2s积累。同时,Rib能降低增值细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和癌基因e IF4E蛋白水平;6、Ch IP实验结果显示,Rib能够降低e IF4E和VEGF启动子区CARM1和H3R17me2a富集。结论:利巴韦林（Ribavirin,Rib）能够抑制肝癌的体内外生长和腹水生成,并延长生存期,其机制与Rib同时降低CARM1和PRMT5蛋白表达、以及H3R17me2a和H3R8me2s/H4R3me2s积累有关。此外,Rib也能够降低肝癌H22腹水瘤模型的腹膜通透性和VEGF水平,以及提高小鼠免疫功能。
邵榆岚[6]（2021）在《抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价》文中研究指明寨卡病毒（ZIKV）和登革病毒（DENV）是最常见的虫媒病毒,通过节肢动物尤其是埃及伊蚊（Aedes.aegypti）或白纹伊蚊（Aedes.albopictus）叮咬感染哺乳动物和人类,经过血液和性接触等在人与人之间传播。近年来,寨卡病毒和登革病毒已经呈现全球广泛流行的严峻态势。据报道,全球约有100多个国家和地区报告了寨卡病毒传播病例,128个国家近40亿人面临登革热病毒感染的风险。我国西南边境的云南省常年遭受东南亚输入性风险和本地感染等巨大威胁。至今,针对寨卡病毒和登革病毒尚无疫苗预防,并且没有特异性治疗药物被批准,灭蚊防叮咬和临床上采用适应症治疗是应对寨卡病毒和登革病毒感染的主要预防控制手段。因此,寨卡病毒和登革病毒的特异性药物研究成为刻不容缓的重要任务。采用已批准的直接抗病毒药物（DAA）治疗是新发病毒药物研究的重要策略之一,DAA药物有可能在黄病毒属病毒上扩大适用症,用于危害严重的寨卡热和登革热患者治疗。本研究论文首先建立抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选的方法体系,然后通过生物信息学分析比较靶标蛋白、分子对接候选DAA化合物,确定待测DAA化合物后进行体外药物效果评价,以期确定现有DAA药物体外抗寨卡病毒和登革病毒的效果,为临床用药提供实验数据。首先,建立抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选方法体系。细胞毒性实验方法为铺板量1×104cells/孔的BHK-21细胞培养过夜后加入阳性药物Ribavirin,作用48 h和72 h的细胞毒性CC50分别为240.5μM和289μM。药物有效性实验方法是在细胞铺板过夜后,采用寨卡病毒和登革病毒最适感染量每孔1×105copies孵育2 h后加入Ribavirin,作用48 h和72 h的抗寨卡病毒有效性EC50分别为1.616μM和3.439μM,抗登革病毒有效性EC50分别为5.919μM和0.2739μM。Ribavirin对ZIKV作用48 h时的选择指数为148.5、72 h时的选择指数为86.25;Ribavirin对DENV2作用48 h的选择指数为40.63、72 h时的选择指数为1087.99。然后,理论分析常见黄病毒科病毒靶标蛋白的基本特征和结构比对,候选DAA化合物与ZIKV、DENV2靶标蛋白进行分子对接和相互作用分析。结果表明,黄病毒属病毒的聚合酶蛋白二级结构组成与分布比蛋白酶蛋白更具有相似性;ZIKV、YFV、WNV的蛋白酶三级结构相似性较高,ZIKV、DENV2、JEV的聚合酶三级结构相似性较高;HCV蛋白酶和聚合酶靶标蛋白与小分子配体的对接口袋适用于黄病毒属病毒;ZIKV、WNV、JEV的蛋白酶进化关系较近,DENV2和YFV的蛋白酶进化关系较近,ZIKV、DENV2、HCV、YFV的聚合酶进化关系较近。分子对接结果确定了Lopinavir、Paritaprevir、Sofosbuvir和Dasabuvir作为待测的DAA化合物;相互作用分析ZIKV蛋白酶与其抑制剂结合比DENV2稳定,Sofosbuvir与ZIKV、DENV2聚合酶靶标蛋白结合比Dasabuvir稳定。最后,待测DAA化合物对寨卡病毒和登革病毒的抗病毒效果进行体外评价,初步获得药物选择指数,采用最适药物浓度进行不同的药物作用时间、病毒感染时间、病毒感染剂量等方面的病毒抑制作用,并且采用药物半数有效浓度进行多靶标联合用药效果评价。结果表明,DAA化合物Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir、Sofosbuvir治疗ZIKV 48 h时的选择指数SI值分别为1466.92、1214.67、949.15、5.87,Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir治疗DENV2 48 h的选择指数SI值分别为540.68、721.13、1173.40,Sofosbuvir治疗DENV2 72 h的选择指数SI值为14.98,4种DAA化合物对ZIKV、DENV2均表现为低毒高效的作用。进一步分析化合物最适药物浓度,随着药物作用时间延长,4种DAA化合物对ZIKV仍然表现出较好抗病毒效果,而对DENV2的病毒抑制率呈下降趋势,其中聚合酶抑制剂对DENV2作用效果较好;随着病毒感染孵育时间延长,4种DAA化合物对ZIKV和DENV2抑制率均降低,Sofosbuvir是长时间感染病毒后治疗效果最好的药物;随着病毒浓度的增加,4种DAA化合物对ZIKV抑制率均降低,聚合酶抑制剂对高剂量DENV2仍然具有明显的抗病毒效果。Lopinavir与Ribavirin或Dasabuvir的联合用药对ZIKV治疗效果最好,Paritaprevir与Sofosbuvir的联合用药抗ZIKV效果较好;Lopinavir的联合用药对DENV2治疗效果不佳,Paritaprevir与Ribavirin或Sofosbuvir的联合用药对DENV2抑制效果较好。综上所述,本研究成功建立了抗寨卡病毒和登革病毒体外药物筛选的方法体系。从理论角度揭示了黄病毒科病毒以蛋白酶和聚合酶作为药物靶标,蛋白质结构方面具有相似性,预示DAA药物能够用于治疗黄病毒属病毒。通过实验数据验证了Lopinavir、Paritaprevir、Dasabuvir、Sofosbuvir对寨卡病毒和登革病毒的药物效果。为治疗寨卡病毒和登革病毒临床用药提供参考。
郑蕊[7]（2020）在《中西药联用临床安全性评价“征靶关联法”的探索及验证》文中提出随着中医药在世界范围内认可度的不断提升,中西药联用的情况越来越普遍,但风险未知。现有针对中西药联用临床安全性研究,关于临床特征与靶点机制的研究相对独立,未能形成有效关联。如仅从药物-临床特征进行研究,干扰因素众多,会出现归因不清的情况;仅从药物-内在机制研究,来自实验室的数据难以直接助力临床决策。如何整合资源,建立可关联临床特征与靶点机制的中西药联用临床安全性评价方法,是目前亟待进行的工作。目的:基于中西药联用临床安全性信息评价,从临床特征与靶点机制关联角度,探索建立中西药联用临床安全性评价方法——“征靶关联法”,用以提示中西药联用风险。从临床上常见、易出现风险的中西药注射剂联用切入,以喜炎平（Xiyanping,XYP）与利巴韦林（Ribavirin,RB）联用的临床安全性评价为实例,初步验证该方法的可行性。方法:1.中西药联用临床安全性信息评价系统收集《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险目录—中成药部分》（2019年）中涉及的中药独家品种与中药注射剂的说明书。按照《中药、天然药物处方药说明书撰写指导原则》、《中成药非处方药说明书规范细则》等相关管理条例的要求,对联用临床安全性信息报告情况进行评价及问题分析。2.“征靶关联法”的探索建立阐释中西药联用安全性评价方法构建思路。从临床特征与靶点机制关联角度,建立“征靶关联法”用于中西药联用临床安全性评价,提示用药风险。探讨“征靶关联法”构成要素、主要特点及实施基础。3.“征靶关联法”应用实例3.1 喜炎平与其他药品联用影响不良反应严重程度的因素识别及分析选取2004年1月至2017年12月间我国自发呈报系统中XYP所有信息。运用单因素方差分析、多因素方差分析、倾向性评分匹配分析集成方法,分析年龄、性别、种族、体重、药物联用等因素对不良反应（Adverse drug reactions,ADRs）严重程度影响。运用变量投影重要性技术（VIP技术）分析影响因素对ADRs严重程度的贡献强度及方向。3.2构建喜炎平-利巴韦林联用临床安全性信息多元证据体以个案报告、随机对照试验、自发呈报系统、医院集中监测试验四大部分数据为来源。运用BCPNN法、Meta分析和传统频数法,分析联用药物-症状联系强度、原发病、ADRs发生率等关键临床特征,构建中西药联用临床安全性信息多元证据体。3.3喜炎平-利巴韦林联用调控皮疹的特征-靶点关联对比分析以RB及XYP主要成分、皮疹为关键词,系统检索文献、药物（疾病）靶点数据库,获得XYP-RB干预皮疹靶点,以Venn图形式表示。使用DAVID、KEGG数据库、Cytoscape 3.7.2软件,对XYP-RB联用调控皮疹靶点群、XYP/RB调控皮疹靶点群、XYP-RB共同作用靶点群,四部分靶点进行功能注释（GO分析）与通路富集（KEGG分析）,对比靶点群生物功能及通路分布,分析联用调控皮疹的可能机制。3.4喜炎平-利巴韦林联用引发类过敏反应（皮疹）实验及机制探索小鼠尾静脉分别注射250mg/kg、500mg/kg剂量的XYP,100mg/kg、150mg/kg剂量的RB及交叉联用,以0.8%伊文思蓝为指示剂,给药30 min后对小鼠耳廓蓝染面积进行评分,留取血清、耳组织。48h后,定量测定耳组织伊文思蓝渗出量。采用Luminex多因子检测技术检测血清中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、L-5、IL-6、CXCL1、IFN-γ、TNF-α的表达。RT-PCR技术检测耳组织中靶蛋白Fas及Caspase 8的mRNA表达,初步探索XYP-RB联用调控类过敏反应机制。结果:1.说明书关于中西药联用临床安全性信息评价共收集692篇中药独家品种说明书。其中21篇注射剂说明书中,95.2%对药物相互作用标注尚无相关信息,4.8%未做相关标注。仅5.2%的非注射剂说明书提示药物相互作用。71.3%说明书对有毒药物、96.3%对配伍禁忌未做相关提示。64.6%说明书对ADRs标注尚不明确,且20.0%对ADRs发生率描述不规范。共收集138篇中药注射剂说明书（52种）。81.9%说明书标注尚无相互作用信息,0.7%标注尚不明确,仅17.4%说明书进行了相关描述。涉及十八反、十九畏使用禁忌的说明书普遍未做提示（75.0%）。18.1%说明书对ADRs标注为尚不明确,且20.2%对ADRs发生率描述不规范。现有中成药说明书关于中西药联用临床安全性信息严重缺失,ADRs、特殊人群用药、禁忌报告等基础信息普遍不明确,针对性研究不足。现有研究方法对临床特征与靶点机制的关联缺失,尚不能满足临床实际需求。2.“征靶关联法”的探索建立“征靶关联法”是指在中西药联用临床安全性评价过程中,通过关联临床特征与靶点机制,来提示联用风险的临床安全性评价方法。构成要素包括风险识别-特征提取-征靶关联-实验验证。其特点是通过对多来源临床数据的系统分析,从作用靶点角度,关联外象表现与内在机制,来评价中西药联用临床安全性。全面高质量的数据来源、多学科团队的技术合作是该方法的实施基础。3.“征靶关联法”应用实例基于自发呈报系统,共纳入26317例XYP相关ADRs。年龄、RB联用是ADRs严重程度的影响因素。单用XYP出现ADRs的严重程度倾向于一般。年龄与联用共同纳入VIP分析中,0-6岁患者倾向于出现一般ADRs,40岁以上患者倾向于严重ADRs。对于0-40岁患者,XYP-RB联用倾向于发生严重ADRs（VIP值>1且相关系数>0）。识别出XYP-RB联用是ADRs严重程度的影响因素且ADRs倾向于严重（0-40岁）。个案报道、医院集中监测未有相关报告,随机对照试验均为低质量研究且存在偏倚风险。多元证据体提示,在小儿轮状病毒性肠炎、上呼吸道感染、小儿上呼吸道感染中,联用不影响RB的ADRs发生率。联用降低了 RB在小儿手足口病（RR=0.52,95%CI=0.36-0.75,P=0.0005）、小儿病毒性肺炎（RR=0.36,95%CI=0.14-0.95,P=0.04）的 ADRs 发生率。小儿手足口病属超说明书用药,涉及ADRs 比重最高。在10-15mg/kg RB与5-10mg/（kg·d）XYP,每日一次条件下,出现ADRs 比例最高,联用组56.9%ADRs为皮肤及其附件反应。皮肤及其附件反应与XYP-RB联用显示强相关E（ICij）=0.70。59.1%ADRs报告在首次联用中出现,其中57.3%表现为皮疹（82.5%）、瘙痒（17.5%）。皮疹为XYP-RB联用主要的临床特征且符合类过敏反应特点。XYP与RB共同调控皮疹靶点有21个。代谢在各靶点谱作用中所占比例最高（58.33%、31.33%、58.82%、60.00%）,可能是 XYP-RB 联用的关键生物功能。XYP 与RB特异性调控皮疹增加了信号转导、蛋白代谢等功能。各部分靶点群在炎症（23.07%以上）、凋亡（53.33%以上）相关通路富集比重较高。单药还可特异性激活HIF-1信号通路、癌症中的MicroRNAs等通路。XYP与RB联用可能是通过在代谢生物功能中的叠加作用,增强调控炎症和凋亡相关通路,同时,可能调控更广泛的靶点通路谱,引发皮疹等ADRs。在类过敏反应实验中,XYP、RB组无血管渗出反应或轻微,联用可见血管通透性显着增高,但耳重未见明显变化。IL-1β与IL-2表达低于检测限度,TNF-α、IFN-γ、CXCL1、IL-5、IL-4给药组与空白组比较,无显着性差异。IL-6在给药组表达均高于空白组（P<0.05）,单用组与联用组比较无显着性差异。与空白组比较,250 mg/kg XYP+150 mg/kg RB组FasmRNA,有显着性升高（P<0.05）,单用组与联用组比较无显着性差异。与空白组比较,250 mg/kg XYP+150mg/kg RB组Caspase 8 mRNA表达有升高趋势,但无显着性差异。结论:本研究在中西药联用临床安全性信息报告分析基础上,从临床特征与靶点机制关联角度,提出“征靶关联法”评价中西药联用临床安全性的观点。将该方法应用于XYP-RB联用临床安全性评价,发现联用可能通过调控IL-6及Fas相关炎症、凋亡通路,导致血管通透性改变,引发类过敏反应,与临床特征皮疹相符,提示XYP-RB联用风险。初步体现了该方法的可行性。
葛素垠[8]（2020）在《利巴韦林通过调节PRMT5抑制结直肠癌生长的作用及机制研究》文中研究表明背景:文献报道及我们前期研究发现,蛋白精氨酸甲基转移酶5（Protein arginine methyltransferase 5,PRMT5）在结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）及多种肿瘤中高表达,且与肿瘤的发生、发展及预后密切相关,是目前药物靶向肿瘤治疗的研究热点。利巴韦林（Ribavirin,RIB）是一种广谱抗病毒药,也是目前临床唯一授权靶向真核翻译起始因子4E（Eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E）的药物,主要用于丙型肝炎的治疗。但关于RIB通过调节PRMT5抑制结直肠癌生长的作用及机制尚不明确。目的:研究RIB通过调节PRMT5抑制结直肠癌体内外生长的作用及表观遗传调控机制。方法:采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）和克隆实验,考察RIB对CRC细胞体外增殖和克隆形成的影响。利用人结肠癌裸鼠皮下移植瘤和偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠（Azoxymethane-dextran sulfate sodium,AOM-DSS）诱导原发性结直肠癌模型,进一步评估RIB在动物体内的抗肿瘤活性。采用化学发光试剂盒检测RIB对PRMT5及PRMT1、4、6和7酶活性的影响,并从基因转录和蛋白翻译水平分析RIB对PRMT5及其组蛋白靶标H3R8me2s/H4R3me2s等癌相关通路的调节。结果:RIB显着抑制CRC细胞体外增殖和克隆形成,并抑制人结肠癌裸鼠皮下移植瘤和AOM-DSS诱导原发性结直肠癌的生长。机制研究发现,RIB诱导细胞周期S期阻滞,促进细胞凋亡,降低Cyclin D1、增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、PRMT5及其组蛋白靶标H3R8me2s/H4R3me2s和eIF4E蛋白水平。结论:RIB通过下调PRMT5蛋白水平及其组蛋白靶标H3R8me2s和H4R3me2s累积,显着抑制CRC细胞的体内外生长。
谢静,唐铭擎,丁立生,梁健,李羿[9]（2020）在《抗COVID-19药物的临床分析研究进展》文中进行了进一步梳理洛匹那韦、利托那韦和利巴韦林是《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》的推荐药物。通过研究近年来洛匹那韦、利托那韦和利巴韦林临床药物分析的进展概况,重点关注药物在血浆中的多种测定方法,包括HPLC、LC-MS、MS、分光光度法、毛细管电泳法、免疫法等,为开展治疗药物监测工作提供参考。
陶嘉磊[10]（2020）在《基于Ⅰ型干扰素信号通路探讨清肺口服液类黄酮组分抗RSV研究》文中指出目的:建立清肺口服液类黄酮组分物质基础库;基于网络药理学方法研究类黄酮组分的主要活性成分和抗RSV潜在作用靶标;研究清肺口服液类黄酮组分对RSV肺炎小鼠模型的防治作用,利用分子生物学技术结合靶标代谢组学方法聚焦Ⅰ型干扰素信号通路,探讨类黄酮组分抗RSV的可能作用机制。方法:类黄酮组分的纯化工艺与定性、定量检测方法:以药液质量浓度、树脂药材质量比、供试品pH、洗脱液体积、醇洗体积分数、洗脱体积流量为考察参数,并以类黄酮含有量为主要评价指标,正交试验优化聚酰胺树脂纯化工艺;应用电喷雾离子源（ESI）,正负离子切换扫描模式采集样品MS/MS数据,通过MS-FINDER平台结合人工核对方法定性分析清肺口服液中类黄酮组分,同时使用UPLC-MS/MS,以CSH-C18色谱柱、ESI,负离子模式SRM方式进行定量分析26种类黄酮。类黄酮组分网络药理学分析:用Swiss Target Prediction与STITCH数据平台对前期鉴定出的76种类黄酮进行成分靶标预测;基于Phenolyzer平台获取RSV相关靶点,利用STRING及Cytoscape软件构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络,同时进行GO分析和KEGG通路富集研究。动物实验研究:利用空斑实验测定RSV毒力,通过RSV滴鼻诱发小鼠肺组织感染模型。造模12 h后使用类黄酮低、高剂量组进行灌胃给药,同时使用利巴韦林作为阳性对照,此外,在滴鼻造模前5天予以类黄酮预防性给药。在RSV感染第4与第6天对小鼠肺组织病理进行分析,并利用IHC方法分析Caspase-3的相对表达量,评价类黄酮对肺组织的保护作用。通过ELISA法和qPCR检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1和IL-10水平,利用流式细胞技术分析CD4+与CD8+T淋巴细胞以及巨噬细胞比例,评价类黄酮组分对于RSV感染小鼠炎症反应和炎症细胞浸润的影响;分别通过qPCR和Western blot检测RSV的F、G、NS1的核酸转录水平和F蛋白的表达量,同时针对F蛋白和RSV使用IHC验证类黄酮对RSV复制的影响;通过ELISA法和qPCR分别检测血清IFN-β以及IFN-α、IFN-β mRNA水平;利用 qPCR 对 MDA5、RIG-I、TBK1、IRF3、JAK1、TYK2、MX1、TRIM5、ISG15、IP-10 mRNA 进行检测,并通过 Western Blot 检测 TBK1、IRF3、p-TBK1、OAS1 水平,以及利用IHC半定量检测MX1、OAS1蛋白水平,评价类黄酮对I型干扰素信号通路的影响;通过靶标代谢组学技术,检测RSV感染第4天小鼠血清、肺组织中与糖代谢、TCA相关的代谢产物水平,探讨类黄酮对RSV感染小鼠能量代谢产物的影响以及与固有免疫的联系。结果:（1）最佳纯化工艺参数为药液质量浓度24 mg/mL,树脂药材质量比25:3,上样液pH值4.0,5 BV水洗除杂,醇洗体积分数80%,醇洗体积6BV,洗脱流量3.0mL/min。纯化后,类黄酮含有量从18.5%提高至68.9%,转移率为78.7%。（2）共有440种类黄酮被初步鉴定出,其中负离子模式266种,正离子模式234种,有60种类黄酮在两种模式下均有良好响应;已知清肺口服液组方各单味药类黄酮共计146种,有78种被检测出;儿茶素、木犀草素等26种类黄酮能够同时被定量检测,其质量浓度与峰面积呈现良好的线性关系（R square>0.9978）。（3）76种类黄酮共挖掘靶标368个,得到与RSV感染共同靶点87个,槲皮素、木犀草素、芹菜素、山奈酚、木犀草苷是类黄酮中主要活性成分,靶标功能富集结果显示清肺类黄酮组分抗RSV作用机制主要与炎症通路、免疫调节、能量代谢、抗病毒感染等途径相关。（4）肺病理结果显示,RSV感染第4、第6天小鼠肺部均有严重的炎症反应,有大小不等的实变病灶、显着浸润的炎症细胞以及明显的血管组织、肺泡组织周边水肿。类黄酮高剂量和预处理组肺组织炎症评分低于模型组;RSV感染后,肺组织Caspase-3表达上调,类黄酮组可部分抑制Caspase-3水平。（5）ELISA、qPCR和流式细胞检测结果显示类黄酮高剂量和预处理组能有效降低IL-1β、TNF-α和TGF-β1炎症因子水平,上调抗炎因子IL-10;类黄酮组分治疗或预处理后有减少CD4+、CD8+T淋巴细胞以及巨噬细胞浸润的趋势。（6）肺组织中可检测到RSV特异性核酸,而在正常组中未检测出。模型组有较强的RSV复制,但肺组织中IFN-α、IFN-β mRNA上调不明显,类黄酮预处理或治疗后均可抑制F蛋白及其mRNA水平,同时对G、NS1核酸转录也有抑制作用,且均能有效上调IFN-αmRNA以及血清、肺组织中IFN-β蛋白水平,对IFN-β mRNA有上调趋势。（7）与正常组相比,模型组TBK1、IRF3mRNA的水平呈现出与RIG-I mRNA相似的上调作用,同时IRF3、p-TBK1蛋白也显着上调,TBK1有上调趋势,对JAK1、TYK2转录无影响,能够提高MX1、TRIM5、ISG15、IP-10转录水平和OAS1蛋白含量;类黄酮高剂量和预处理均能促进TBK1磷酸化,提高JAK1、IP-10、ISG15 mRNA水平,对TYK2 mRNA无影响,对OAS1蛋白有上调作用。（8）与正常组相比,模型组血清中丙酮酸、乳酸、顺式乌头酸均上调,琥珀酸、3-磷酸甘油酸有上调趋势,α-酮戊二酸有下调趋势;类黄酮高剂量组能够逆转RSV感染诱导的丙酮酸、乳酸、顺式乌头酸、3-磷酸甘油酸的上调,能够下调血清苹果酸水平,有降低琥珀酸趋势;利巴韦林的干预造成了血清中乳酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸、柠檬酸进一步上调。与正常组相比,模型组肺组织中丙酮酸、乳酸等1 1种目标代谢物均显着上调;类黄酮高剂量组能够逆转RSV感染诱导的肺组织乳酸、3-磷酸甘油酸、富马酸、苹果酸、葡萄糖的上调,能够进一步上调肺组织丙酮酸水平,有降低磷酸烯醇式丙酮酸、琥珀酸趋势;与模型组比,西药利巴韦林的干预可以下调葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸水平,但造成了肺组织更高水平的乳酸堆积。结论:（1）采用聚酰胺树脂纯化清肺口服液中的类黄酮稳定可靠、效果良好;运用MS-DAIL联合MS-FINDER分析鉴别类黄酮简单高效,可作为初步鉴定中药类黄酮成分的首选方法。（2）UPLC-QE-Orbitrap-MS结合MS-FINDER可快速定性分析清肺口服液中的类黄酮;利用UPLC-MS/MS技术,使用CSH-C18色谱柱可以高效、可重复的同时定量检测清肺口服液类黄酮组分中26种类黄酮。（3）通过LC-MS与网络药理学研究方法,获得清肺口服液类黄酮组分抗RSV的作用机制主要与炎症通路、免疫调节、能量代谢、抗病毒感染等途径相关,证实了复方多靶点、多途径的治疗特点。（4）每只BALB/c小鼠给予5 × 10^5 PFU的RSV滴鼻可引起显着的肺组织炎症反应和病理损伤;类黄酮组分可有效抑制炎症反应,改善肺组织病理损伤,减少炎性细胞浸润和细胞凋亡,同时RSV滴鼻造模能够在肺组织检测到RSV特异性核酸和蛋白,而类黄酮治疗可有效抑制RSV复制。（5）RSV感染可抑制宿主细胞Ⅰ型IFN的转录,干扰机体正常的抗病毒免疫反应,同时造成宿主血清、肺组织能量代谢紊乱,乳酸堆积;类黄酮可激活Ⅰ型IFN信号通路,促进TBK1磷酸化,上调抗病毒蛋白水平,改善RSV诱导的代谢紊乱,同时类黄酮能够有效预防RSV感染,激活宿主Ⅰ型干扰素信号通路,对宿主能量代谢失衡也有一定预防作用。（6）类黄酮所表现出的激活Ⅰ型干扰素信号通路作用可能是通过拮抗TGF-β1活性、与病毒非结构蛋白结合、改善宿主能量代谢并下调乳酸水平等方式间接实现。（7）利巴韦林能够有效抑制RSV的复制,但在改善肺组织病理损伤、炎症反应等方面不及类黄酮,且能够引起宿主更强烈的能量代谢紊乱,诱导血清、肺组织乳酸水平升高,抑制宿主细胞正常的抗病毒免疫功能,这可能是临床使用不能获益的内在原因。
二、利巴韦林制剂的应用和定量分析方法概述（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利巴韦林制剂的应用和定量分析方法概述（论文提纲范文）
（1）戊肝病毒新型复制子细胞系及沙鼠感染模型的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)分子生物学概述 |
| 1.1 病毒基因组 |
| 1.2 HEV蛋白功能 |
| 1.2.1 ORF1 蛋白 |
| 1.2.2 ORF2 蛋白 |
| 1.2.3 ORF3 蛋白 |
| 2 戊型肝炎病毒(HEV)流行情况概述 |
| 2.1 HEV的地理分布情况 |
| 2.2 HEV跨物种传播情况 |
| 2.3 HEV慢性感染情况 |
| 3 HEV细胞培养体系及入侵机制研究进展 |
| 3.1 HEV感染性克隆的研究进展 |
| 3.2 HEV细胞培养体系研究进展 |
| 3.3 HEV入侵机制 |
| 4 HEV动物感染模型研究进展 |
| 4.1 非人灵长类HEV感染模型 |
| 4.2 鼠类HEV感染模型 |
| 4.2.1 肝脏人源化小鼠感染模型 |
| 4.2.2 大鼠感染模型 |
| 4.2.3 沙鼠感染模型 |
| 4.3 猪HEV感染模型 |
| 4.4 新西兰大白兔HEV感染模型 |
| 4.5 鸡HEV感染模型 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 HEV RNA复制子细胞系的建立与鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 设计思路 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 细胞、菌株、抗体、HEV感染性克隆等材料 |
| 3.2 主要试剂与溶液 |
| 3.2.1 转染及细胞培养实验相关试剂 |
| 3.2.2 分子克隆实验相关试剂 |
| 3.2.3 Western Blot实验相关试剂 |
| 3.2.4 其他试剂 |
| 3.3 试剂与溶液配制 |
| 3.3.1 免疫荧光实验相关试剂的配制 |
| 3.3.2 蛋白电泳实验相关试剂的配制 |
| 3.3.3 Northern Blot相关试剂的配制 |
| 3.3.4 细菌培养相关试剂的配制 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 HEV复制子载体p6-EGFPZeocin(p6-EZ)的构建 |
| 4.1.1 融合PCR |
| 4.1.2 DNA琼脂糖胶回收方法 |
| 4.1.3 酶切PCR融合产物和载体并用T4 DNA酶连接 |
| 4.1.4 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 4.2 HEV复制子载体p6-EZ的线性化及体外转录 |
| 4.3 Northern Blot检测HEV复制子p6-EZ细胞系 |
| 4.3.1 Trizol法提取RNA |
| 4.3.2 Notthern Blot的操作方法 |
| 4.4 间接免疫荧光检测 |
| 4.5 Western Blot的操作方法 |
| 4.6 细胞传代的操作方法 |
| 4.7 Lipo3000 转染操作方法 |
| 5 实验结果与分析 |
| 5.1 构建基因3型HEV复制子p6-EGFAZeocin(p6-EZ)载体 |
| 5.2 以HEV复制子p6-EZ为模板进行体外转录 |
| 5.3 HEV复制子细胞系的筛选及阳性率鉴定 |
| 5.4 RNA水平上证明细胞系中存在HEV复制子 |
| 5.4.1 Northern Blot检测细胞系中存在HEV复制子的基因组RNA |
| 5.4.2 IFA检测到HEV复制子细胞系中存在双链RNA(dsRNA) |
| 5.5 蛋白水平上证明细胞系中存在HEV复制子 |
| 5.6 HEV复制子细胞系稳定性检测 |
| 6 讨论 |
| 第二章 基因3 型HEV沙鼠感染模型的建立 |
| 1 引言 |
| 2 设计思路 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 细胞、小分子抑制剂、HEV活病毒及实验动物 |
| 3.2 主要试剂与溶液 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 动物实验 |
| 4.1.1 沙鼠肝内接种“加帽”的基因3型HEV RNA |
| 4.1.2 沙鼠灌胃接种基因3 型rHEV |
| 4.1.3 腹腔接种rHEV导致沙鼠感染并导致肝脏出现病理损伤 |
| 4.1.4 基因3 型HEV沙鼠感染模型测试利巴韦林和干扰素抗病毒效果 |
| 4.1.5 沙鼠肝内接种“加帽”的基因 1 型和基因 4型HEV RNA |
| 4.2 Trizol法提取RNA |
| 4.3 RT-qPCR检测方法 |
| 4.4 组织学与免疫组织化学评价(IHC) |
| 5 实验结果与分析 |
| 5.1 肝内接种“加帽”的HEV RNA导致沙鼠感染 |
| 5.1.1 鉴定体外转录获得的HEV RNA质量 |
| 5.1.2 肝内接种“加帽”HEV RNA导致沙鼠粪便排毒和内脏器官感染 |
| 5.1.3 肝内接种“加帽”HEV RNA导致沙鼠血清中HEV IgG抗体转阳 |
| 5.1.4 肝内接种“加帽”HEV RNA后,在肝脏中检测到HEV活病毒 |
| 5.1.5 沙鼠感染HEV导致肝脏出现病理损伤 |
| 5.2 灌胃接种rHEV导致沙鼠感染并出现肝脏病理损伤 |
| 5.3 腹腔接种rHEV导致沙鼠感染 |
| 5.3.1 腹腔接种rHEV导致沙鼠粪便排毒和内脏器官的感染 |
| 5.3.2 腹腔接种rHEV导致沙鼠血清中HEV IgG抗体转阳 |
| 5.3.3 腹腔接种rHEV导致沙鼠肝脏出现病理损伤 |
| 5.3.4 腹腔接种rHEV沙鼠肝脏研磨液中检测到HEV活病毒 |
| 5.4 HEV沙鼠感染模型评价利巴韦林和干扰素的抗病毒效果 |
| 5.4.1 沙鼠感染HEV早期,利巴韦林和干扰素的抗病毒效果 |
| 5.4.2 当体内HEV强感染时,利巴韦林和干扰素的抗病毒效果 |
| 5.5 沙鼠肝内接种基因4型HEV“加帽”RNA导致感染 |
| 6 讨论 |
| 第三章 HEV感染抑制Ⅰ型干扰素信号通路激活 |
| 1 引言 |
| 2 设计思路 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 细胞、质粒、抗体 |
| 3.2 主要试剂与溶液 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 动物实验 |
| 4.2 Western Blot的操作方法 |
| 4.3 Trizol法提取RNA |
| 4.4 RT-qPCR检测方法 |
| 4.5 组织学与免疫组织化学评价(IHC) |
| 5 实验结果与分析 |
| 5.1 TBK1 抑制剂对S10-3-EZ中 HEV复制子的影响 |
| 5.2 TBK1 抑制剂对HEV活病毒感染的影响 |
| 5.3 Ⅰ型干扰素通路对S10-3-EZ中 HEV复制子的影响 |
| 5.4 S10-3-EZ和S10-3 天然免疫应答的差异 |
| 5.5 TBK1 小分子抑制剂对HEV在沙鼠体内感染的影响 |
| 6 讨论 |
| 第四章 HEV抗病毒药物高通量筛选及药物抗病毒机制初探 |
| 1 引言 |
| 2 设计思路 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 细胞与siRNA |
| 3.2 主要试剂与溶液 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 Trizol法提取RNA |
| 4.2 RT-qPCR检测方法 |
| 5 实验结果与分析 |
| 5.1 IFN-α在两种HEV复制子细胞系中的抗病毒作用 |
| 5.2 利巴韦林在两种HEV复制子细胞系中的抗病毒作用 |
| 5.3 siRNA在 HEV复制子细胞系中的抗病毒作用 |
| 5.4 利用HEV复制子细胞系对小分子抑制剂库进行高通连筛选 |
| 5.5 HSP90 抑制剂在HEV复制子细胞系中的抗病毒作用 |
| 5.6 HSP90 小分子抑制剂导致ORF1 降解 |
| 6 讨论 |
| 第五章 通过沙鼠感染模型评价抗病毒药物对HEV的抑制作用 |
| 1 引言 |
| 2 设计思路 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 细胞、小分子抑制剂和实验动物 |
| 3.2 主要试剂与溶液 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 动物实验 |
| 4.1.1 测试NVP-HSP90 抑制沙鼠体内HEV感染的最低有效剂量 |
| 4.1.2 优化NVP-HSP90 治疗HEV在沙鼠体内感染的用药顺序 |
| 4.1.3 测试HEV在沙鼠体内强烈感染时NVP-HSP90 的抗病毒效果 |
| 4.1.4 测试NVP-HSP90 抑制基因4型HEV在沙鼠体内感染的效果 |
| 4.2 Trizol法提取RNA |
| 4.3 RT-qPCR检测方法 |
| 5 实验结果与分析 |
| 5.1 优化NVP-HSP90 治疗沙鼠感染HEV的给药剂量 |
| 5.2 HEV在沙鼠体内强烈感染时NVP-HSP90 的治疗效果 |
| 5.3 检测抗病毒药物对沙鼠感染基因4 型HEV的治疗作用 |
| 6 讨论 |
| 全文总结 |
| 结论和创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 主要成果情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（2）质谱法检测禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 常见抗病毒药物 |
| 1.1.2 抗病毒药物在畜禽养殖中使用产生的问题 |
| 1.2 利巴韦林和金刚烷胺概述 |
| 1.2.1 利巴韦林 |
| 1.2.2 金刚烷胺 |
| 1.3 液相色谱-串联质谱法概述 |
| 1.3.1 液相色谱法概述 |
| 1.3.2 高效液相色谱法概述 |
| 1.3.3 液相色谱-串联质谱法概述 |
| 1.4 课题研究内容和意义 |
| 第二章 鸡组织中利巴韦林和金刚烷胺残留消除规律的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 溶液的配制 |
| 2.2.3 试验动物给药方案 |
| 2.2.4 样品采集与保存 |
| 2.2.5 色谱条件 |
| 2.2.6 质谱条件 |
| 2.2.7 样品处理 |
| 2.2.8 检测方法的考察 |
| 2.2.9 鸡组织中利巴韦林和金刚烷胺残留量的测定 |
| 2.2.10 数据分析处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 离子色谱图 |
| 2.3.2 母离子与子离子的确定 |
| 2.3.3 样品的确证 |
| 2.3.4 检测方法参数的验证 |
| 2.3.5 鸡组织中利巴韦林和金刚烷胺残留量测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 金刚烷胺在鸡组织中的残留消除规律 |
| 2.4.2 利巴韦林在鸡组织中的残留消除规律 |
| 2.4.3 .结论 |
| 第三章 高分辨质谱查找利巴韦林和金刚烷胺代谢物 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 利巴韦林和金刚烷胺药代动力学 |
| 3.2.1 利巴韦林 |
| 3.2.2 金刚烷胺 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 仪器与试剂 |
| 3.3.2 标准溶液配制 |
| 3.3.3 样品净化 |
| 3.3.4 色谱条件 |
| 3.3.5 质谱条件 |
| 3.3.6 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 提取条件的优化 |
| 3.4.2 色谱条件的选择 |
| 3.4.3 质谱条件的选择 |
| 3.4.4 标准品扫描分析 |
| 3.4.5 样品扫描分析 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 齐鲁工业大学2021年上半年毕业研究生科研情况汇总表 |
（3）基于自噬途径研究小柴胡汤对甲型流行性感冒的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、现代医学对甲型流行性感冒的认识 |
| 1 流感病毒的致病机制:感染与免疫 |
| 2 流感病毒与细胞自噬 |
| 3 现代医学对甲型流行性感冒的治疗 |
| 4 基于科学计量学(citespace)探讨甲型流感研究领域与自噬领域的共同机制 |
| 二、中医对甲型流行性感冒的认识 |
| 1 甲型流行性感冒的病因病机 |
| 2 甲型流行性感冒的辨证论治 |
| 三、伤寒少阳病的病因病机演变及特点 |
| 1 少阳之源 |
| 2 伤寒少阳病的病因病机、证治及演变 |
| 四、小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的历史渊源 |
| 1 小柴胡汤方解 |
| 2 小柴胡汤对甲型流行性感冒的治疗 |
| 3 小柴胡汤的现代药理学研究 |
| 五、小柴胡汤与细胞自噬 |
| 1 细胞自噬与流感致病的中医认识 |
| 2 小柴胡汤主要成分对细胞自噬的调控 |
| 第二部分 基于网络药理学方法探讨小柴胡汤治疗甲型流行性感冒的潜在作用机制 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 不同方式制备的小柴胡汤对甲型H1N1 流感病毒感染MDCK细胞的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 小柴胡汤颗粒剂对H1N1 流感病毒感染人A549 细胞的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 小柴胡汤及拆方颗粒剂对甲型流感病毒感染MDCK细胞自噬流的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 小柴胡汤及拆方颗粒剂对甲型流感病毒感染MDCK细胞自噬作用机制的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 1 理论研究思路及结果讨论 |
| 2 不足与展望 |
| 3 创新点 |
| 附录 |
| 综述一 甲型H1N1 流行性感冒的溯源与防治 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医对甲型流行性感冒的认识 |
| 参考文献 |
| 附录三 攻博期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）利巴韦林调节PRMT1和PRMT5抑制软组织肉瘤生长的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验药品 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 细胞株 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 MTT实验 |
| 1.2.3 平板克隆实验 |
| 1.2.4 流式细胞术(FCM)检测细胞周期 |
| 1.2.5 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡 |
| 1.2.6 S180小鼠皮下移植瘤模型 |
| 1.2.7 S180小鼠肺转移模型 |
| 1.2.8 S180小鼠腹水瘤模型 |
| 1.2.9 小鼠腹膜通透性实验 |
| 1.2.10 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 1.2.11 小鼠脾脏淋巴细胞检测 |
| 1.2.12 Western blot |
| 1.2.13 实时荧光定量PCR测定 |
| 1.2.14 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 1.2.15 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 PRMT1和PRMT5在不同肉瘤细胞株中的蛋白表达 |
| 2.2 RIB对肉瘤细胞体外增殖的影响 |
| 2.3 RIB显着降低软组织肉瘤细胞中PRMT1和PRMT5蛋白表达水平 |
| 2.4 RIB降低软组织肉瘤细胞中H4R3me2a、H4R3me2s和H3R8me2s的积累 |
| 2.5 RIB降低软组织肉瘤细胞中PRMT1和PRMT5 mRNA水平 |
| 2.6 RIB显着降低软组织肉瘤细胞中eIF4E蛋白表达水平 |
| 2.7 RIB诱导软组织肉瘤细胞G0/G1期阻滞 |
| 2.8 RIB诱导软组织肉瘤细胞发生凋亡 |
| 2.9 RIB抑制S180小鼠皮下移植瘤的生长并增强DOX的体内抗肿瘤活性 |
| 2.10 RIB对S180皮下移植瘤组织中PRMT1和PRMT5及其特异性组蛋白靶标的调节 |
| 2.11 RIB抑制S180细胞的肺部转移 |
| 2.12 RIB对早期和晚期S180腹水瘤小鼠生存期的影响 |
| 2.12.1 RIB延长早期(Early stage)S180腹水瘤小鼠生存期 |
| 2.12.2 RIB延长晚期(Advanced stage)S180腹水瘤小鼠生存期 |
| 2.13 RIB降低S180腹水瘤小鼠腹膜通透性和腹水中VEGF水平 |
| 2.14 RIB对PRMT1和PRMT5在VEGF启动子区富集的影响 |
| 2.15 RIB减轻S180腹水瘤小鼠免疫器官损伤 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）利巴韦林通过调节CARM1和PRMT5抑制肝癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 药品 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 仪器和设备 |
| 1.6 PCR引物 |
| 1.7 分析软件 |
| 1.8 抗体 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 主要试剂及药物配制 |
| 2.2 细胞增殖 |
| 2.3 细胞克隆 |
| 2.4 流式细胞仪PI单染色法检测细胞周期 |
| 2.5 流式细胞仪AnnexinⅤ和PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.6 肝癌H22 小鼠皮下移植瘤模型 |
| 2.7 人肝癌裸鼠原位移植瘤模型 |
| 2.8 组织病理切片和H&E染色 |
| 2.9 肝癌H22 小鼠腹水瘤模型 |
| 2.10 H22 腹水瘤模型中腹膜通透性检测 |
| 2.11 H22 腹水瘤模型中VEGF-A检测 |
| 2.12 荧光实时定量PCR(Real Time Quantitative,RT-q PCR) |
| 2.13 Western blot |
| 2.14 染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP) |
| 2.15 Rib对腹水瘤模型中小鼠的免疫调节作用 |
| 2.16 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CARM1和PRMT5在HCC细胞中蛋白表达水平 |
| 3.2 Rib抑制HCC细胞体外增殖 |
| 3.3 Rib抑制HCC细胞克隆形成 |
| 3.4 Rib阻滞HCC细胞周期在S期 |
| 3.5 Rib对 HCC细胞凋亡的影响 |
| 3.6 Rib抑制HCC体内肿瘤生长 |
| 3.7 Rib抑制H22 腹水瘤生成,延长生存期 |
| 3.8 Rib能降低腹膜通透性,抑制腹水中VEGF-A生成 |
| 3.9 Rib降低人肝癌细胞中CARM1和PRMT5 的蛋白表达水平 |
| 3.10 Rib降低人肝癌细胞中CARM1和PRMT5特异性组蛋白靶标H3R17me2a和H3R8me2s/H4R3me2s积累 |
| 3.11 Rib降低肝癌组 织中CARM1 蛋白水平及其特异性组 蛋白靶标H3R17me2a积累 |
| 3.12 Rib不影响人肝癌细胞或组织中的CARM1和PRMT5 m RNA水平 |
| 3.13 Rib抑制CARM1 和 H3R17me2a在 e IF4E 和 VEGF启动子区的富集,并降低e IF4E 和 VEGF m RNA水平 |
| 3.14 Rib刺激小鼠的免疫器官,调节免疫功能 |
| 3.15 Rib可促进小鼠血清中干扰素IFN-γ生成 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文术语缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 寨卡病毒和登革病毒的流行与危害 |
| 1.1.1 寨卡病毒发现与流行 |
| 1.1.2 登革病毒起源与流行 |
| 1.1.3 寨卡病毒和登革病毒的危害与防控 |
| 1.2 寨卡病毒和登革病毒的病原学特征 |
| 1.2.1 寨卡病毒和登革病毒的基因组学 |
| 1.2.2 寨卡病毒和登革病毒的生命周期 |
| 1.3 寨卡病毒和登革病毒潜在的药物治疗靶点 |
| 1.3.1 寨卡病毒和登革病毒关键蛋白的结构功能与药物靶点 |
| 1.3.2 HCV药物靶点 |
| 1.4 直接作用抗病毒药物 |
| 1.5 计算机辅助药物筛选方法 |
| 1.6 体外药物筛选的方法 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 研究技术路线 |
| 第二章 抗登革病毒和寨卡病毒药物筛选方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 BHK-21和C6/36细胞的培养 |
| 2.3.2 ZIKV和DENV2病毒的培养 |
| 2.3.3 构建Real Time PCR绝对定量标准曲线法检测病毒载量 |
| 2.3.3.1 方法原理与引物 |
| 2.2.3.2 提取病毒RNA |
| 2.2.3.3 一步法反转扩增目的片段 |
| 2.2.3.4 目的片段回收纯化 |
| 2.2.3.5 CaCl_2法制备感受态细胞 |
| 2.2.3.6 TA克隆 |
| 2.2.3.7 提取质粒DNA |
| 2.2.3.8 建立探针法绝对定量PCR标准曲线 |
| 2.3.4 BHK-21细胞生长规律 |
| 2.3.4.1 CCK-8原理及方法 |
| 2.3.4.2 细胞生长规律 |
| 2.3.5 病毒与细胞的最适感染复数 |
| 2.3.6 阳性化合物利巴韦林的细胞毒性测定 |
| 2.3.7 阳性化合物利巴韦林对病毒的抑制作用 |
| 2.3.7.1 .药物对病毒复制的抑制 |
| 2.3.7.2 药物作用后的病毒载量检测 |
| 2.3.8 阳性化合物的选择指数测定 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 ZIKV和DENV2的cDNA质粒标准品及qRT-PCR标准曲线法 |
| 2.4.2 BHK-21细胞生长特性 |
| 2.4.3 确定最适感染复数 |
| 2.4.4 阳性化合物利巴韦林抗ZIKV和DENV2活性 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 候选DAA化合物与寨卡病毒和登革病毒靶标蛋白的分子对接 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验研究对象 |
| 3.2.2 主要数据分析方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 靶标蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.2 靶标蛋白三级结构比对分析 |
| 3.3.3 靶标蛋白系统发育分析 |
| 3.3.4 候选DAA化合物与ZIKV和DENV2靶标蛋白分子对接 |
| 3.3.5 待测DAA化合物与ZIKV和DENV2靶标蛋白相互作用分析 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 靶标蛋白及DAA药物的确定 |
| 3.4.2 靶标蛋白的理化性质 |
| 3.4.3 靶标蛋白的疏水性质 |
| 3.4.4 靶标蛋白的二级结构 |
| 3.4.5 靶标蛋白的三级结构比对 |
| 3.4.6 靶标蛋白的系统发育 |
| 3.4.7 候选DAA化合物与ZIKV和DENV2的分子对接 |
| 3.4.8 待测DAA化合物与ZIKV和DENV2的相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 待测DAA化合物抗寨卡病毒和登革病毒的药效评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 待测DAA化合物的细胞毒性测定 |
| 4.3.2 待测DAA化合物对病毒的抑制作用 |
| 4.3.3 待测DAA化合物的选择指数测定 |
| 4.3.4 待测DAA化合物抗病毒最适药物浓度确定 |
| 4.3.5 最适药物浓度对药物作用时间依赖性分析 |
| 4.3.6 最适药物浓度对病毒感染时间依赖性分析 |
| 4.3.7 最适药物浓度对病毒感染剂量依赖性分析 |
| 4.3.8 多靶点联合用药分析 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 待测DAA化合物抗ZIKV和DENV2活性 |
| 4.4.2 待测DAA化合物抗病毒最适药物浓度确定 |
| 4.4.3 最适药物浓度的药物作用时间依赖性 |
| 4.4.4 最适药物浓度的病毒感染时间依赖性 |
| 4.4.5 最适药物浓度的病毒感染剂量依赖性 |
| 4.4.6 多靶点联合用药效果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 建立抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系 |
| 5.2 候选DAA化合物与寨卡病毒和登革病毒靶标蛋白的分子对接 |
| 5.3 待测DAA化合物抗寨卡病毒和登革病毒药物效果评价 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表的论文 |
（7）中西药联用临床安全性评价“征靶关联法”的探索及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中西药联用临床安全性评价研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药注射剂不良反应主要临床特征及相关机制 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 中西药联用临床安全性信息评价 |
| (一) 中药独家品种说明书关于中西药联用临床安全性信息评价 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| (二) 中药注射剂说明书关于中西药联用临床安全性信息评价 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| (三) 中西药联用临床安全性信息问题分析 |
| 1. 信息缺失,针对性研究不足 |
| 2. 现有方法不能满足实际需求 |
| 第二部分 中西药联用临床安全性评价“征靶关联法”的探索建立 |
| (一) 中西药联用临床安全性评价方法的构建思路 |
| 1. 西药-西药联用临床安全性评价 |
| 2. 不良反应外象表现与内在机制关联 |
| 3. 临床特征与靶点机制关联 |
| 4. 建立中西药联用临床安全性评价的特征与靶点关联模式 |
| (二) “征靶关联法”的提出 |
| (三) “征靶关联法”的构成要素 |
| 1. 临床联用不良反应严重程度影响因素识别(风险识别) |
| 2. 构建临床中西药联用安全信息多元证据体(特征提取) |
| 3. 临床特征-靶点对应分析(征靶关联) |
| 4. 实验验证 |
| (四) “征靶关联法”的主要特点 |
| 1. 多来源真实世界数据总结临床特征 |
| 2. 基于作用靶点角度分析内在机制 |
| 3. 临床特征与靶点机制形成关联 |
| (五) “征靶关联法”的实施基础 |
| 1. 全面高质量的数据来源 |
| 2. 多学科团队的技术共融 |
| 第三部分 “征靶关联法”应用实例 |
| (一) 喜炎平与其他药品联用影响不良反应严重程度的因素识别及分析 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 研究结果 |
| 4. 小结 |
| (二) 构建喜炎平-利巴韦林联用临床安全性信息多元证据体 |
| 1. 医院集中监测研究证据 |
| 2. 个案报告证据 |
| 3. 随机对照试验证据 |
| 4. 自发呈报系统证据 |
| 5. 喜炎平-利巴韦林联用多元证据体及可能机制分析 |
| 6. 小结 |
| (三) 喜炎平-利巴韦林联用调控皮疹的特征-靶点关联对比分析 |
| 1. 喜炎平-利巴韦林联用调控皮疹靶点检索与筛选 |
| 2. 基于功能注释进行喜炎平-利巴韦林联用调控皮疹的关联对比分析 |
| 3. 基于通路富集进行喜炎平-利巴韦林联用调控皮疹的关联对比分析 |
| 4. 小结 |
| (四) 喜炎平-利巴韦林联用引发类过敏反应(皮疹)实验及机制探索 |
| 1. 喜炎平-利巴韦林联用引发类过敏反应(皮疹)实验 |
| 2. 喜炎平-利巴韦林联用引发类过敏反应(皮疹)细胞因子表达 |
| 3. 喜炎平-利巴韦林联用引发类过敏反应(皮疹)靶点mRNA表达 |
| 4. 小结 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）利巴韦林通过调节PRMT5抑制结直肠癌生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 立题依据 |
| 第一章 实验材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 药品 |
| 1.3 常规试剂 |
| 1.4 仪器及设备 |
| 1.5 抗体明细 |
| 1.6 分析软件 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 临床研究 |
| 2.2 细胞增殖 |
| 2.3 细胞克隆 |
| 2.4 细胞周期 |
| 2.5 细胞凋亡 |
| 2.6 人结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 2.7 偶氮甲烷-葡聚糖硫酸钠诱导原发性结直肠癌模型 |
| 2.8 荧光实时定量PCR |
| 2.9 Western blot |
| 2.10 PRMT5及家族酶活性检测 |
| 2.11 组织病理切片H&E染色 |
| 2.12 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 e IF4E在人CRC组织高表达 |
| 3.2 RIB抑制CRC细胞体外增殖 |
| 3.3 RIB抑制CRC细胞克隆形成 |
| 3.4 RIB联用5-FU/ADM/DDP抑制体外CRC细胞增殖 |
| 3.5 RIB抑制BALB/c裸小鼠皮下瘤的生长 |
| 3.6 RIB抑制AOM-DSS诱导原发性CRC的生长 |
| 3.6.1 RIB抑制AOM-DSS诱导原发性CRC生长 |
| 3.6.2 CRC组织和主要脏器病理学H&E染色 |
| 3.7 RIB诱导CRC细胞周期S期阻滞 |
| 3.8 RIB诱导CRC细胞凋亡 |
| 3.9 RIB对 PRMT5 mRNA转录水平的调节 |
| 3.10 RIB对 PRMT5 及其他蛋白水平的调节 |
| 3.10.1 RIB对 CRC细胞中PRMT5 及其他蛋白水平的调节 |
| 3.10.2 RIB对 CRC组织中PRMT5 及其他蛋白水平的调节 |
| 3.11 RIB对 PRMT5 及其它家族成员酶活性的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）抗COVID-19药物的临床分析研究进展（论文提纲范文）
| 1 洛匹那韦和利托那韦的体内药物分析 |
| 1.1 HPLC及LC-MS |
| 1.2 MS |
| 1.3 薄层色谱法 |
| 1.4 分光光度法 |
| 2 利巴韦林的体内药物分析 |
| 2.1 HPLC及LC-MS |
| 2.2 毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE) |
| 2.3 免疫分析法 |
| 2.4 分光光度法 |
| 3 小结 |
（10）基于Ⅰ型干扰素信号通路探讨清肺口服液类黄酮组分抗RSV研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对RSV的研究进展 |
| 1.1 RSV流行病学研究 |
| 1.2 RSV结构特征 |
| 1.3 RSV感染复制与病理学特点 |
| 1.4 RSV的临床诊断 |
| 1.5 RSV的预防和治疗 |
| 2 中医药防治RSV的研究现状 |
| 2.1 中医药防治RSV感染的临床研究 |
| 2.2 中医药防治RSV的基础研究 |
| 3 宿主抗病毒先天免疫反应 |
| 3.1 病毒感染模式识别受体及信号转导 |
| 3.2 Ⅰ型干扰素的信号转导与抗病毒作用 |
| 4 类黄酮抗病毒感染的研究进展 |
| 4.1 类黄酮的广泛生物学活性 |
| 4.2 类黄酮抗病毒作用的多种途径 |
| 5 本实验研究思路 |
| 第二部分 清肺口服液类黄酮组分的提取与鉴定 |
| 1 清肺口服液类黄酮纯化的工艺研究 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 MS-DAIL联合MS-FINDER鉴定中药类黄酮 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 UPLC-QE-Orbitrap-MS技术结合MS-FINDER快速分析清肺口服液中类黄酮组分 |
| 3.1 仪器与试药 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 UPLC-MS/MS法测定清肺口服液类黄酮组分中26种类黄酮 |
| 4.1 仪器与试药 |
| 4.2 方法与结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第三部分 基于网络药理学方法研究清肺口服液类黄酮组分抗RSV作用机制 |
| 1 中药复方的网络药理学研究现状及几个关键问题 |
| 1.1 网络药理学概述 |
| 1.2 中药复方网络药理学研究的现状 |
| 1.3 中药复方网络药理学研究中的几个关键问题 |
| 2 清肺口服液类黄酮组分抗RSV网络药理学研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第四部分 动物实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RSV感染Hep-2细胞空斑实验结果 |
| 3.2 RSV感染对小鼠一般情况的影响 |
| 3.3 类黄酮组分有效改善肺组织病理损伤,抑制Caspase-3蛋白的表达 |
| 3.4 类黄酮组分抑制炎症反应,减少炎症细胞的浸润 |
| 3.5 类黄酮组分对RSV复制及F蛋白的影响 |
| 3.6 类黄酮组分上调IFN-α、IFN-β mRNA,提高血清、肺组织IFN-β含量 |
| 3.7 类黄酮组分促进Ⅰ型IFN上游TBK1的磷酸化水平 |
| 3.8 类黄酮组分激活Ⅰ型IFN下游抗病毒蛋白OAS1、ISG15表达 |
| 3.9 类黄酮组分改善能量代谢,降低乳酸水平 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 结语 |
| 1 结论 |
| 2 本研究创新之处 |
| 3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 英文缩写词表 |
| 2 UPLC-MS联合MS-FINDER初步鉴定出的440种类黄酮 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、利巴韦林制剂的应用和定量分析方法概述（论文参考文献）
- [1]戊肝病毒新型复制子细胞系及沙鼠感染模型的建立与应用[D]. 徐令东. 浙江大学, 2021
- [2]质谱法检测禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的研究[D]. 李楠. 齐鲁工业大学, 2021(10)
- [3]基于自噬途径研究小柴胡汤对甲型流行性感冒的干预作用[D]. 王上. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [4]利巴韦林调节PRMT1和PRMT5抑制软组织肉瘤生长的作用及机制[D]. 张青青. 兰州大学, 2021(09)
- [5]利巴韦林通过调节CARM1和PRMT5抑制肝癌生长的作用及机制研究[D]. 田一贞. 兰州大学, 2021(09)
- [6]抗寨卡病毒和登革病毒药物筛选体系建立及DAA药物的药效评价[D]. 邵榆岚. 昆明理工大学, 2021(01)
- [7]中西药联用临床安全性评价“征靶关联法”的探索及验证[D]. 郑蕊. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]利巴韦林通过调节PRMT5抑制结直肠癌生长的作用及机制研究[D]. 葛素垠. 兰州大学, 2020(01)
- [9]抗COVID-19药物的临床分析研究进展[J]. 谢静,唐铭擎,丁立生,梁健,李羿. 中国现代应用药学, 2020(06)
- [10]基于Ⅰ型干扰素信号通路探讨清肺口服液类黄酮组分抗RSV研究[D]. 陶嘉磊. 南京中医药大学, 2020(08)